As técnicas de engenharia genética

O que é a reação em cadeia da polimerase (PCR) e para que é utilizada? Refere duas situações práticas nas quais seja indispensável amplificar ADN.

O esquema ilustra um ciclo de PCR com as suas três etapas numeradas e a temperatura de cada uma. Explica o que ocorre em cada etapa e justifica por que razão cada uma requer a sua temperatura característica.

Para amplificar por PCR um fragmento de ADN de cadeia dupla alvo, conhece-se a sequência das extremidades de uma das suas cadeias (lida no sentido 5' $\rightarrow$ 3'):

5'-ATGCCGTAG... [fragmento alvo de $600\ \text{pb}$] ...ACGTTCGAT-3'

1. a) Desenha a sequência e a polaridade (5' $\rightarrow$ 3') dos dois iniciadores de ADN (de 9 nucleótidos cada um) necessários para amplificar essa região. Justifica por que razão ambos os iniciadores devem ter sequências distintas e orientar-se em sentidos convergentes.
2. b) Um estudante programa o termociclador com os seguintes ciclos: $60\ \text{°C}$ (emparelhamento) e $72\ \text{°C}$ (alongamento), omitindo intencionalmente o passo a $95\ \text{°C}$. Após 30 ciclos, analisa a amostra por eletroforese e não observa nenhuma banda. Justifica a nível molecular a causa do insucesso.
3. c) Se partires de 2 moléculas de ADN de cadeia dupla iniciais e a reação tiver uma eficiência teórica de $100\ \%$, deduz quantas moléculas de cadeia dupla que contenham exclusivamente o comprimento exato delimitado pelos iniciadores se terão gerado ao concluir-se o terceiro ciclo da PCR. Justifica a tua resposta fundamentando passo a passo o que acontece em cada ciclo.

Num laboratório pretende-se amplificar um gene humano mediante PCR, mas por engano um técnico utiliza ADN polimerase I purificada de Escherichia coli em vez da polimerase Taq habitual de Thermus aquaticus.

1. a) Se for aplicado o programa térmico padrão ($95\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$ e $72\ \text{°C}$ durante $1\ \text{min}$, repetido 30 vezes), prevê que resultado se obterá na eletroforese em gel de agarose e justifica molecularmente o que acontece à enzima de E. coli durante o primeiro ciclo.
2. b) Nos primórdios da técnica, antes do isolamento de polimerases termófilas, a PCR realizava-se com ADN polimerase I de E. coli. Descreve a modificação do protocolo experimental que os investigadores deviam levar a cabo em cada um dos 30 ciclos para conseguir a amplificação e explica que inconvenientes práticos colocava.
3. c) A polimerase Taq carece de atividade exonucleásica 3' $\rightarrow$ 5', ao contrário de outras polimerases termoestáveis como a Pfu. Justifica qual das duas enzimas é mais indicada para amplificar um gene com fins terapêuticos onde não se tolerem erros de sequência, explicando a função da referida atividade enzimática.

O que são enzimas de restrição, a partir de que organismos são obtidas e qual é a sua função na engenharia genética?

O que é um organismo transgénico? Dá um exemplo e explica, em linhas gerais, como se obtém.

Ordena as etapas necessárias para clonar um gene humano em bactérias e justifica a sequência: introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, clivar o gene e o plasmídeo com a mesma enzima de restrição, ligar o gene ao plasmídeo com a ADN ligase, selecionar e multiplicar as bactérias transformadas.

Um grupo de investigação quer sintetizar a hormona peptídica insulina na bactéria Escherichia coli. Para isso, isolam diretamente o gene da insulina a partir do ADN nuclear de células pancreáticas humanas e inserem-no num plasmídeo bacteriano junto a um promotor eficaz de E. coli.

1. a) Após introduzirem o plasmídeo nas bactérias, verificam que se sintetiza um polipéptido aberrante, inativo e de tamanho incorreto. Explica por que razão o ADN genómico eucariótico não pode expressar-se adequadamente numa bactéria, fazendo referência à estrutura do gene e à maquinaria de processamento do ARN.
2. b) Desenha a estratégia biotecnológica para resolver este problema: indica que molécula deves isolar como molde inicial, que tipo de iniciador sintético específico utilizarias aproveitando uma modificação pós-transcricional dessa molécula e que enzima de origem vírica utilizarás para sintetizar a primeira cadeia de ADN complementar (ADNc).
3. c) Ao comparar a sequência do ADNc obtido com a do gene nuclear inicial, verifica-se que o ADNc é muito mais curto e carece da sequência promotora original humana. Explica por que razão isto ocorre e justifica como se consegue que a bactéria transcreva esse ADNc uma vez clonado no plasmídeo.

O sistema CRISPR-Cas9 permite editar o genoma com elevada precisão. Explica de forma simples que função desempenha o ARN guia e que função desempenha a proteína Cas9 nesta técnica.