Cultura e controlo de microrganismos

O que é um meio de cultura e que condições (nutrientes, temperatura, pH, oxigénio) são controladas ao cultivar bactérias no laboratório? Indica a diferença entre um meio sólido e um meio líquido.

Explica o que é a técnica asséptica de trabalho no laboratório de microbiologia e justifica o sentido de duas práticas concretas: flamejar a ansa de sementeira até ficar em brasa e trabalhar na proximidade da chama do bico de Bunsen.

Os vírus não se multiplicam em placas de ágar. Justifica o motivo (o que lhes falta para se multiplicarem autonomamente?) e indica que sistemas utilizam os laboratórios para os cultivar (culturas celulares, ovos embrionados).

O gráfico representa a curva de crescimento de uma cultura bacteriana em sistema fechado, com as suas quatro fases assinaladas com números (1 a 4). Nomeia cada fase e explica o que acontece com os nutrientes e os resíduos em cada uma delas.

Uma bactéria divide-se a cada $20$ minutos. Partindo de $1\,000$ células em fase exponencial, calcula quantas existirão após duas horas (quantas gerações ocorrem?). Em seguida, justifica por que razão o crescimento exponencial não pode manter-se numa cultura fechada (que fatores o travam?).

Distingue esterilização, desinfeção e antissepsia, e dá um exemplo de situação (bloco operatório, bancada de cozinha, ferida superficial) em que se aplica cada uma delas.

Compara a eficácia da lixívia, do álcool a $70\ \%$ e do sabão contra bactérias e vírus envelopados. Explica por que razão o álcool a $70\ \%$ desinfeta melhor do que o álcool quase puro (papel da água na desnaturação de proteínas e na penetração) e que efeito tem exatamente o sabão sobre um invólucro viral lipídico.

Na unidade de esterilização de um hospital devem processar:

1) Caixas de instrumental cirúrgico de aço inoxidável (fórceps, retratores/afastadores).

2) Laparoscópios e óticas endoscópicas com fibra de vidro e plásticos termossensíveis (temperatura máxima tolerada: 55,0 °C).

3) Seringas e cateteres plásticos descartáveis embalados em grande quantidade em caixas de cartão fechadas.

1. a) Atribui e justifica o método ótimo para cada material entre: autoclave de vapor sob pressão, câmara de gás de óxido de etileno e radiação ionizante gama, detalhando por que razão os métodos descartados em cada caso seriam menos adequados (arruinariam o material, não penetrariam adequadamente ou seriam menos práticos ou seguros).
2. b) Durante um ciclo de autoclave (134,0 °C durante 5 minutos), o termómetro e o manómetro registaram os valores prescritos e a fita adesiva indicadora externa mudou de cor corretamente. Contudo, ao incubar o indicador biológico (ampola com 10^6 endósporos de Geobacillus stearothermophilus colocada no centro da carga) a 56,0 °C durante 24 horas, o caldo muda de púrpura para amarelo e apresenta turvação.

Interpreta o sucedido, decide fundamentadamente se se pode autorizar o uso do instrumental e justifica por que razão o controlo biológico prevalece sobre os controlos físicos e químicos.

Refere quatro métodos de controlo microbiano na indústria alimentar (pasteurização, esterilização UHT, refrigeração e congelação, salga ou cura) e explica o princípio em que cada um se baseia (mata, inibe ou dificulta o crescimento?).

Explica em que consiste a pasteurização (temperatura e tempo, por exemplo $72\ \text{°C}$ durante $15$ segundos), por que razão não esteriliza o alimento (o que sobrevive?) e que doenças históricas ajudou a controlar no leite (tuberculose, brucelose).

Num workshop de conservas caseiras, dois grupos elaboram couve fermentada (chucrute), cuja conservação depende da microbiota lática epífita (Leuconostoc e Lactobacillus):

• Grupo 1: Corta a couve, adiciona 2,5 % de sal comum em peso, prensa a mistura até que o líquido cubra completamente o vegetal e veda o frasco impedindo a entrada de ar, mantendo-o a 20,0 °C. Ao fim de três semanas, o preparado apresenta um pH de 3,6 e um odor ácido fresco.

• Grupo 2: Corta a couve, não adiciona sal para «torná-lo mais saudável para o coração», deixa o frasco aberto ao ar e adiciona água quente a 45,0 °C. Aos 4 dias, o pH mantém-se em 6,2, há bolor na superfície e liberta um odor fétido.

1. a) Justifica o duplo papel seletivo dos 2,5 % de sal e da imersão anóxica no procedimento do Grupo 1 face a bactérias concorrentes de origem telúrica e enterobactérias.
2. b) Explica a alteração metabólica que produz a descida do pH até 3,6 e fundamenta por que motivo esta diminuição inibe o desenvolvimento dos endósporos de Clostridium botulinum, um bacilo anaeróbio estrito que tolera a anoxigenia, mas é sensível à acidez.
3. c) Prevê que falhas bioquímicas e ecológicas provocou o protocolo do Grupo 2 e por que razão a combinação de temperatura a 45,0 °C e presença de oxigénio impediu a fermentação lática espontânea.

Um biorreator industrial produz iogurte, cerveja ou insulina em grande escala. Explica que parâmetros são controlados de forma contínua (temperatura, pH, oxigénio dissolvido, agitação, espuma) e justifica o que acontece ao produto se dois deles, à tua escolha, ficarem descontrolados.

Distingue um antibiótico bactericida de um bacteriostático, apresenta um exemplo de cada tipo (penicilina versus tetraciclinas) e explica o que acontece à população bacteriana ao suspender cada um deles.

O que é um antibiograma e como se realiza (discos de antibiótico sobre a placa semeada)? Explica que informação transmite ao médico (sensível, intermédio, resistente) e por que razão não deve prescrever-se um antibiótico sem essa informação, sempre que seja possível obtê-la.

Planifica uma atividade experimental para comparar a eficácia de dois desinfetantes contra uma bactéria da pele: placas, controlos, medição de halos de inibição e critérios para concluir qual é o mais eficaz, indicando as variáveis que manterias constantes.

Explica, através da seleção natural, como surge uma população bacteriana resistente a um antibiótico quando o tratamento é interrompido antes do tempo, e por que razão o antibiótico não «cria» a resistência.

Muitos antibióticos são produtos naturais de bactérias do solo (estreptomicetos). Explica que vantagem evolutiva confere ao organismo produtor a síntese de um antibiótico (guerra química pelos nutrientes) e analisa por que razão a descoberta de novos antibióticos abrandou nas últimas décadas.

Um doente diagnosticado com gripe insiste em que lhe receitem amoxicilina «para o caso de a infeção descer para o peito», enquanto um criador de gado administra tetraciclina em doses baixas contínuas na água de bebida de porcos saudáveis para «acelerar a sua engorda e prevenir diarreias».

1. a) Rebate a partir da base bioquímica e citológica a exigência do doente: justifica por que razão os antibióticos beta-lactâmicos são totalmente inócuos para os vírus e prevê que impacto seletivo imediato causará essa amoxicilina sobre a microbiota comensal do próprio doente.
2. b) Interpreta a prática pecuária descrita sob a perspetiva da seleção natural: explica por que razão as concentrações subterapêuticas e contínuas representam o cenário ideal para selecionar bactérias resistentes em comparação com as doses letais completas.
3. c) Explica os mecanismos de transferência horizontal (conjugação, transformação e transdução) através dos quais um gene de resistência gerado numa bactéria comensal do gado pode acabar numa estirpe patogénica humana num ambiente hospitalar.

O que é a transferência horizontal de genes e em que se distingue da hereditariedade «vertical» dos progenitores para a descendência? Nomeia os seus três mecanismos nas bactérias.

Descreve os três mecanismos de transferência horizontal de genes bacteriana — conjugação, transformação e transdução —, indicando que veículo transporta o ADN em cada caso e qual deles intervém na disseminação de resistências.

A colistina é um antibiótico polipeptídico que desestabiliza a membrana externa de bactérias gram-negativas e que durante anos foi considerado um «último recurso» médico. Em 2015, detetou-se em explorações suinícolas o gene mcr-1, capaz de conferir resistência à colistina, localizado num plasmídeo conjugativo.

1. a) Justifica por que razão a descoberta do gene mcr-1 num plasmídeo gerou um alarme sanitário mundial incomparavelmente maior do que se a resistência se devesse a uma mutação pontual no cromossoma bacteriano.
2. b) Durante décadas, a colistina foi administrada em doses baixas contínuas no gado suíno como promotor de crescimento. Explica, a partir da teoria da seleção natural, como esta prática zootécnica criou as condições ideais para a seleção e fixação do gene mcr-1.
3. c) Apoiando-te na estratégia «Uma Só Saúde» (One Health), argumenta por que razão a legislação proibiu o uso preventivo da colistina na pecuária e contesta a posição de um produtor que alegue que «as bactérias do intestino do gado não têm forma de chegar aos doentes de uma UCI humana».

Na UCI de um hospital deteta-se um surto de Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenemes que afeta quatro doentes internados com cateteres venosos e ventilação mecânica assistida.

1. a) Analisa a cadeia epidemiológica do surto: identifica a fonte provável, o mecanismo de transmissão mais plausível (veículo e vetor passivo) e justifica que fatores fisiológicos tornam estes doentes especialmente vulneráveis.
2. b) Desenha um plano de contingência com medidas de controlo classificadas por ordem de prioridade (isolamento e barreiras físicas, rastreio ativo e desinfeção de fómites), justificando biologicamente por que razão a higiene das mãos entre doentes é mais crítica para travar a transmissão do que a fumigação ambiental.
3. c) Avalia criticamente a seguinte proposta: «Para erradicar o surto pela raiz, administraremos colistina profilática a todos os doentes internados na UCI, tenham ou não sintomas». Prevê as consequências seletivas e evolutivas desta medida a médio prazo.

Após um banquete escolar, 48 comensais desenvolvem gastroenterite aguda por Salmonella enterica. Na inspeção, são recolhidas amostras dos alimentos consumidos (maionese caseira, frango assado e bolo) e do pessoal da cozinha. O laboratório realiza o isolamento em placa e analisa o perfil genético através de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE).

1. a) O cultivo resulta positivo para S. enterica tanto na maionese como em restos de frango cru na bancada. Contudo, o padrão de bandas de ADN dos doentes coincide a 100 % com o isolado na maionese e difere do isolado no frango cru. Interpreta este resultado e deduz a origem da intoxicação, justificando por que razão a identificação molecular é indispensável face ao simples cultivo taxonómico da espécie.
2. b) A maionese foi preparada com ovos às 7:30 h e permaneceu à temperatura ambiente (24,0 °C) até ao seu consumo às 14:30 h (7 horas no total). Se a contaminação inicial no lote foi de 10 bactérias/g e o tempo de duplicação a essa temperatura é de 30 minutos, calcula a concentração teórica final por grama e justifica como teria modificado o risco manter o prato refrigerado a 4,0 °C desde a sua preparação.
3. c) Desenha um sistema de análise de perigos e pontos críticos de controlo (HACCP) para a cozinha do estabelecimento que previna simultaneamente a contaminação biológica inicial, a contaminação cruzada e a proliferação microbiana.

Um doente com fibrose cística sofre de uma infeção pulmonar crónica por uma estirpe de Pseudomonas aeruginosa pan-resistente (resistente a todos os antibióticos disponíveis). A equipa médica pondera o uso compassivo de fagoterapia.

1. a) No laboratório dispõem de dois tipos de bacteriófagos: o fago ΦA (estritamente lítico) e o fago ΦB (fago lisogénico ou temperado). Justifica qual dos dois deve ser selecionado obrigatoriamente para o tratamento e que risco clínico grave implicaria administrar o fago lisogénico.
2. b) Após administrar uma dose inalada de fagos líticos, a carga bacteriana na expetoração desce em 72 horas de 8,0 · 10^7 para 3,0 · 10^2 UFC/mL, enquanto o título de fagos aumenta de 1,0 · 10^5 para 4,5 · 10^9 UFP/mL. Compara esta cinética com a farmacocinética de um antibiótico químico tradicional e deduz que vantagem apresenta o bacteriófago relativamente à dosagem no foco infecioso.
3. c) Ao dia 14, a carga bacteriana do doente volta a subir para 6,0 · 10^6 UFC/mL. A análise demonstra que as bactérias sobreviventes perderam o recetor de membrana OprM que o fago utilizava para se fixar. Explica por que razão o desenho terapêutico baseado num «cocktail» de vários fagos direcionados a recetores celulares independentes minimiza o fracasso do tratamento face ao uso de uma única estirpe viral.

Desafio do tema. Será a tua cozinha um meio de cultura ideal para agentes patogénicos ou um ambiente hostil digno de uma arqueobactéria extremófila? Desenha um protocolo de biossegurança alimentar para a tua casa.

1. Recolha de dados: Mede com um termómetro a temperatura interior do teu frigorífico e da bancada, ou consulta a temperatura atual do teu município no site da AEMET. Regista ambos os valores (por exemplo, $4,1\text{ }^\circ\text{C}$ e $21,8\text{ }^\circ\text{C}$).

2. Análise microbiana: Elabora uma tabela que compare a faixa ótima de proliferação de eubactérias mesófilas comuns com as adaptações de arqueobactérias extremófilas (psicrófilas ou termófilas), deduzindo quais os microrganismos que prosperariam em cada zona medida.

3. Estratégias de controlo: Propõe três medidas de controlo do crescimento bacteriano para alimentos do dia a dia (como calor a mais de $72,5\text{ }^\circ\text{C}$, salga osmótica ou refrigeração), explicando de que forma alteram a viabilidade da parede ou da membrana bacteriana.

4. Produto final: Redige um relatório breve de uma página que reúna as tuas medições, a tabela comparativa eubactérias-arqueobactérias e o teu protocolo fundamentado de conservação.

Avaliar-se-á:

• Registo rigoroso de dados térmicos reais utilizando a vírgula decimal.

• Diferenciação biológica correta entre a fisiologia de eubactérias e arqueobactérias.

• Justificação científica dos métodos de cultura e de controlo microbiano aplicados.