Die DNA-Replikation

Was bedeutet es, dass die DNA-Replikation semikonservativ ist? Erkläre es mit eigenen Worten und gib an, wie die beiden Tochter-DNA-Moleküle aufgebaut sind.

In welcher Phase des Zellzyklus wird die DNA repliziert, und warum ist es unerlässlich, dass die Replikation vor Beginn der Zellteilung stattfindet?

Vor dem berühmten Experiment von Meselson und Stahl gab es drei theoretische Modelle zur Erklärung der DNA-Verdopplung: semikonservativ, konservativ und dispersiv. Stellen Sie sich vor, Sie führen dieses Experiment durch, indem Sie E. coli-Bakterien über viele Generationen in einem Medium mit schwerem Stickstoff ($^{15}\text{N}$) kultivieren, bis ihre gesamte DNA markiert ist, und sie dann in ein Medium mit leichtem Stickstoff ($^{14}\text{N}$) überführen.

1. a) Leiten Sie her, welche Arten von DNA-Molekülen (schwer $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, hybrid $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ oder leicht $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) und in welchen Anteilen nach einer und nach zwei Generationen im Dichtegradienten auftreten würden, wenn die Replikation

1. streng konservativ

2. streng dispersiv

verliefe.

1. b) Begründen Sie, welches dieser beiden alternativen Modelle bereits durch die Analyse der DNA der ersten Generation verworfen wurde und für welches zwingend die zweite Generation abgewartet werden musste, um es zu widerlegen.

Nenne das Hauptenzym, das den neuen DNA-Strang während der Replikation synthetisiert, erkläre seine grundlegende Funktion und in welcher Richtung (5'→3' oder 3'→5') es die Nukleotide anfügt.

Nenne das Enzym, das die DNA-Doppelhelix an der Replikationsgabel öffnet, und erkläre, welches mechanische Problem im Molekül vor der Gabel auftritt (Superspiralisierung) und welche Art von Enzym es löst.

Erkläre die Rolle des RNA-Primers zu Beginn der Replikation und begründe, warum die DNA-Polymerase keinen neuen Strang von Grund auf beginnen kann.

An einer Replikationsgabel wird einer der neuen Stränge (A) kontinuierlich synthetisiert und wächst auf die Gabel zu, während der andere (B) in Fragmenten synthetisiert wird, die sich von ihr entfernen. Gib an, welcher der neuen Stränge (A oder B) der Leitstrang und welcher der Folgestrang ist, und erkläre, warum der eine kontinuierlich und der andere in Okazaki-Fragmenten synthetisiert wird, indem du auf die Richtung eingehst, in der die DNA-Polymerase arbeitet.

Ordne die folgenden Schritte der Replikation und begründe die gewählte Reihenfolge: Verknüpfung der Fragmente durch die DNA-Ligase, Öffnung der Doppelhelix durch die Helikase, Synthese von Nukleotidketten durch die DNA-Polymerase, Entfernung der Primer, Bildung der Okazaki-Fragmente.

Nenne das Enzym, das die RNA-Primer während der Replikation synthetisiert, und erkläre, warum jedes Okazaki-Fragment seinen eigenen Primer braucht, während der Leitstrang nur am Anfang einen einzigen benötigt.

Womit werden die Lücken aufgefüllt, nachdem die RNA-Primer des Folgestrangs entfernt wurden, und welches Enzym verschließt anschließend den Strang? Erkläre, warum der Folgestrang später fertiggestellt wird als der Leitstrang.

Um die Synthese der neuen DNA-Stränge während der Replikation zu analysieren, wird in einer Bakterienkultur ein Pulse-Chase-Experiment durchgeführt: Die Zellen werden einem ultrakurzen Puls von $5$ Sekunden radioaktivem Thymidin ($[^3\text{H}]\text{-Thymidin}$) ausgesetzt und danach für $5$ Minuten in ein Medium mit überschüssigem nicht radioaktivem Thymidin überführt (Chase). Nach Lyse und alkalischer Denaturierung werden die DNA-Stränge im Dichtegradienten in der Zentrifuge getrennt. a) Sagen Sie voraus und begründen Sie, welches Größenmuster radioaktiver Fragmente (kleine mit etwa $1000$–$2000$ Nukleotiden oder mit hoher Molekülmasse) am Ende des Pulses ($5$ s) zu beobachten ist und wie es sich nach dem Chase ($5$ min) verändert. b) Wird derselbe Versuch mit einem mutierten Stamm durchgeführt, dessen DNA-Ligase thermisch blockiert ist, sagen Sie das Ergebnis nach den $5$ Minuten Chase voraus und begründen Sie Ihre Antwort. c) Begründen Sie, warum dieses Experiment die Hypothese widerlegt, dass beide Stränge kontinuierlich synthetisiert werden.

Es wird eine temperatursensitive Hefemutante für das Gen isoliert, das die DNA-Ligase I codiert. Bei $25\text{ }^\circ\text{C}$ teilt sich die Hefe normal, aber bei Kultivierung bei $37\text{ }^\circ\text{C}$ wird das Enzym inaktiv und die Zelle stoppt ihren Zellzyklus vor dem Eintritt in die Mitose. a) Ein Schüler behauptet: „Bei $37\text{ }^\circ\text{C}$ weist nur der Folgestrang Brüche auf, weil sich in ihm die Okazaki-Fragmente bilden; der Leitstrang wird eine einzige, von einem Ende des Chromosoms zum anderen vollkommen durchgehende Kette sein.“ Widerlegen Sie diese Aussage unter Berücksichtigung der mehreren Replikationsursprünge (Replikons) pro linearem Chromosom. b) Geben Sie die genaue Art der chemischen Bindung an, die ohne Ligase nicht verschlossen werden kann (unter Angabe der endständigen chemischen Gruppen $3'$ und $5'$), und begründen Sie, warum DNA-Polymerasen diese Verknüpfungsreaktion nicht allein ausführen können. c) Begründen Sie, warum unverschlossene Brüche in der Doppelhelix einen Kontrollpunkt des Zellzyklus aktivieren und die Mitose verhindern.

Um zu prüfen, ob die Replikation kontinuierlich oder diskontinuierlich verläuft, führen Forschende in Bakterien eine Markierung mit tritiiertem Thymidin durch Pulse von $5$, $15$ und $60$ Sekunden durch. Nach Denaturierung der DNA analysieren sie die Größe der radioaktiven Stränge durch Zentrifugation. Nach $5$ Sekunden finden sie nur kurze Fragmente ($1000$–$2000$ Nukleotide), doch mit zunehmender Markierungsdauer verschiebt sich die Radioaktivität schrittweise zu Fragmenten mit großer Molekülgröße. a) Begründen Sie, warum dieses Ergebnis dafür spricht, dass die Replikation semidiskontinuierlich und nicht an beiden Strängen kontinuierlich erfolgt. b) Sagen Sie voraus und begründen Sie, welches Ergebnis bei den drei Messungen erzielt worden wäre, wenn beide Stränge ausgehend vom Replikationsursprung kontinuierlich synthetisiert würden. c) Erklären Sie die zwingende molekulare (strukturelle und enzymatische) Ursache, aus der die Zelle gezwungen ist, einen der beiden Stränge aus kleinen Fragmenten aufzubauen.

Welches Nukleotid wird während der Replikation gegenüber einem Adenin des Matrizenstrangs eingebaut? Und gegenüber einem Guanin? Erkläre, welche Eigenschaft der DNA-Struktur eine getreue Kopie ermöglicht.

Die in den neuen Strang eingebauten Nukleotide liegen als Triphosphate vor (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Erkläre, woher die Zelle die Energie bezieht, die für die Bildung der Bindungen in der wachsenden Kette nötig ist.

Die chemische Analyse der DNA einer Art zeigt, dass $30\ \%$ ihrer Basen Adenin sind. Gib mit Begründung die Anteile von Thymin, Guanin und Cytosin an und erkläre, welche Folge diese Komplementarität für die DNA-Replikation hat.

In einem Labor wird ein mutierter Stamm von Escherichia coli gewonnen, der eine Veränderung in der DNA-Polymerase III aufweist: Ihre Polymerisationsgeschwindigkeit in Richtung $5'\to 3'$ bleibt unverändert, aber ihre Exonuklease-Aktivität $3'\to 5'$ ist vollständig verloren gegangen. a) Sagen Sie voraus und begründen Sie, welche Auswirkung diese Mutation auf die Kopiergenauigkeit und auf die Rate spontaner Mutationen pro Zellteilung hat. b) Wird dieser Stamm in Gegenwart von 2-Aminopurin (einem Basenanalogon, das sich fälschlich mit Cytosin paaren kann) kultiviert, begründen Sie, ob die Rate der fixierten Mutationen größer, kleiner oder gleich der im Wildtyp-Stamm sein wird. c) Begründen Sie auf molekularer Ebene, warum die Korrekturleseaktivität das fehlerhafte Nukleotid in Richtung $3'\to 5'$ entfernen muss, bevor das nächste Nukleotid angefügt wird.

Die DNA-Replikation erreicht dank dreier aufeinanderfolgender Barrieren eine außerordentliche Genauigkeit: die Paarungsspezifität der DNA-Polymerase (Fehler von $1$ pro $10^5$ Nukleotide), das Korrekturlesen durch die Exonuklease $3'\to 5'$ (Endfehler von $1$ pro $10^7$) und das postreplikative System zur Reparatur von Fehlpaarungen (Mismatch Repair, Endfehler von $1$ pro $10^9$). a) Eine Zelllinie eines erblichen Darmkrebses (Lynch-Syndrom) weist eine $100$-fach höhere Mutationsrate als normal auf, obwohl ihre DNA-Polymerasen intakte Polymerase- und Exonuklease-Aktivitäten besitzen. Leiten Sie her und begründen Sie, welcher Mechanismus in diesen Zellen versagt. b) Um einen Fehler nach dem Durchlaufen der Gabel zu korrigieren, muss das Reparatursystem den Matrizenstrang (alt) vom neu synthetisierten Strang unterscheiden. Erörtern Sie, wie die Zellmaschinerie beide Stränge unterscheidet, um zu vermeiden, dass die Base des ursprünglichen Strangs ersetzt wird. c) Entgeht eine Fehlpaarung (z. B. ein Guanin, das fälschlich einem Thymin gegenübersteht) allen Korrektursystemen und durchläuft die Zelle zwei vollständige Zellteilungszyklen, leiten Sie her, welcher Anteil der endgültigen Tochter-DNA-Moleküle die dauerhaft fixierte Mutation trägt.

Wie viele Replikationsgabeln entstehen von einem einzelnen Replikationsursprung aus, und in welche Richtung bewegen sie sich? Erkläre, welchen Vorteil es hat, dass eukaryotische Chromosomen viele Replikationsursprünge besitzen.

Nenne zwei Unterschiede zwischen der Replikation eines Bakterienchromosoms und der eines menschlichen Chromosoms im Hinblick auf die Form der DNA und die Anzahl der Replikationsursprünge.

Die DNA-Polymerase von E. coli fügt an jeder Gabel etwa $1000$ Nukleotide pro Sekunde an. Berechne, wie lange die Replikation ihres ringförmigen Chromosoms von $4,6$ Millionen Basenpaaren mindestens dauert, wenn es von einem einzigen Ursprung aus bidirektional repliziert wird, und kommentiere das Ergebnis im Vergleich zur Generationszeit des Bakteriums (etwa $20$ Minuten).

Nach der Replikation besteht jedes Chromosom aus zwei Schwesterchromatiden. Erkläre, in welcher Beziehung die DNA-Sequenzen beider Chromatiden zueinander stehen, warum sie eine Zeit lang verbunden bleiben und zu welchem Zeitpunkt der Zellteilung sie sich trennen.

Im Labor werden zwei menschliche Zellkulturen verglichen: normale dermale Fibroblasten und Krebszellen einer Lungenkarzinom-Zelllinie. Über $60$ Populationsverdopplungen wird die mittlere Telomerlänge beobachtet. Die Fibroblasten treten bei der Verdopplung $40$ mit fortschreitender Telomerverkürzung in die replikative Seneszenz ein, während die Krebszellen kontinuierlich proliferieren und die Länge ihrer Telomere unverändert beibehalten. a) Begründen Sie auf molekularer Ebene, warum die herkömmliche Replikationsmaschinerie das $5'$-Ende des Folgestrangs nach Entfernung des letzten RNA-Primers nicht vollständig kopieren kann (das „Endproblem“). b) Es wird eine Therapie entwickelt, die ein synthetisches Oligonukleotid in die Tumorzellen einbringt, das komplementär zur Matrizen-RNA des menschlichen Telomerase-Ribonukleoproteins (hTR) ist. Sagen Sie voraus und begründen Sie, welche Wirkung diese Behandlung auf die Telomeraseaktivität, die Telomerlänge und die langfristige Lebensfähigkeit der Tumorzellen hat.

In frühen Embryonen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster dauert die S-Phase nur $5$ Minuten, während sie sich in adulten somatischen Zellen über etwa $8$ Stunden erstreckt. Die Geschwindigkeit der Replikationsgabel ist dagegen in beiden Stadien identisch: etwa $40$ Nukleotide pro Sekunde. a) Hat das haploide Genom von Drosophila $1,8 \cdot 10^8$ Basenpaare, berechnen Sie den maximalen mittleren Abstand (in Basenpaaren), der im Embryo zwischen zwei benachbarten aktiven Replikationsursprüngen liegen darf, damit die Replikation in $5$ Minuten abgeschlossen wird; nehmen Sie dabei bidirektionale Replikation an. b) Deuten Sie, worauf der Unterschied in der Dauer der S-Phase zwischen Embryo und adultem Tier beruht, wenn sich die Polymerisationsgeschwindigkeit nicht ändert. c) Begründen Sie, welches Risiko für das Genom entstünde, wenn derselbe Replikationsursprung innerhalb einer einzigen S-Phase zweimal aktiviert („gezündet“) würde, und wie die Zelle dies verhindert.