Gentechnische Verfahren

Was ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und wofür wird sie eingesetzt? Nennen Sie zwei praktische Situationen, in denen die Vervielfältigung von DNA unverzichtbar ist.

Das Schema zeigt einen PCR-Zyklus mit seinen drei nummerierten Schritten und der Temperatur jedes Schritts. Erklären Sie, was in jedem Schritt geschieht, und begründen Sie, warum jeder Schritt seine charakteristische Temperatur benötigt.

Um ein doppelsträngiges Ziel-DNA-Fragment mittels PCR zu vervielfältigen, ist die Sequenz der Enden eines seiner Stränge bekannt (gelesen in 5'$\rightarrow$3'-Richtung):

5'-ATGCCGTAG... [Zielfragment von $600\ \text{bp}$] ...ACGTTCGAT-3'

1. a) Entwerfen Sie die Sequenz und die Polarität (5' $\rightarrow$ 3') der beiden DNA-Primer (mit je 9 Nukleotiden), die zur Vervielfältigung dieser Region nötig sind. Begründen Sie, warum beide Primer unterschiedliche Sequenzen haben und in konvergenter Richtung ausgerichtet sein müssen.
2. b) Ein Schüler programmiert den Thermocycler mit den folgenden Zyklen: $60\ \text{°C}$ (Annealing) und $72\ \text{°C}$ (Elongation) und lässt den Schritt bei $95\ \text{°C}$ absichtlich aus. Nach 30 Zyklen analysiert er die Probe per Elektrophorese und sieht keine Bande. Begründen Sie auf molekularer Ebene die Ursache des Misserfolgs.
3. c) Man geht von 2 doppelsträngigen DNA-Molekülen zu Beginn aus, und die Reaktion hat eine theoretische Effizienz von $100\ \%$. Leiten Sie ab, wie viele doppelsträngige Moleküle, die ausschließlich die durch die Primer exakt begrenzte Länge enthalten, nach Abschluss des dritten PCR-Zyklus entstanden sind. Begründen Sie Ihre Antwort, indem Sie Schritt für Schritt erläutern, was in jedem Zyklus geschieht.

In einem Labor soll ein menschliches Gen mittels PCR vervielfältigt werden, doch aus Versehen verwendet ein Techniker gereinigte DNA-Polymerase I aus Escherichia coli statt der üblichen Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus.

1. a) Wird das übliche Temperaturprogramm angewendet ($95\ \text{°C}$ für $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ für $30\ \text{s}$ und $72\ \text{°C}$ für $1\ \text{min}$, 30-mal wiederholt), sagen Sie voraus, welches Ergebnis in der Agarose-Gelelektrophorese zu sehen sein wird, und begründen Sie molekular, was mit dem E.-coli-Enzym im ersten Zyklus geschieht.
2. b) In den Anfängen der Methode, vor der Isolierung thermophiler Polymerasen, wurde die PCR mit der DNA-Polymerase I aus E. coli durchgeführt. Entwerfen Sie die Änderung des Versuchsprotokolls, die die Forschenden in jedem der 30 Zyklen vornehmen mussten, um eine Vervielfältigung zu erreichen, und erklären Sie, welche praktischen Nachteile dies mit sich brachte.
3. c) Die Taq-Polymerase besitzt im Gegensatz zu anderen thermostabilen Polymerasen wie Pfu keine 3' $\rightarrow$ 5'-Exonuklease-Aktivität. Begründen Sie, welches der beiden Enzyme sich besser eignet, um ein Gen für therapeutische Zwecke zu vervielfältigen, bei denen keine Sequenzfehler toleriert werden, und erläutern Sie die Funktion dieser enzymatischen Aktivität.

Was sind Restriktionsenzyme, aus welchen Organismen werden sie gewonnen und welche Funktion haben sie in der Gentechnik?

Was ist ein transgener Organismus? Nennen Sie ein Beispiel und erklären Sie in groben Zügen, wie er hergestellt wird.

Bringen Sie die Schritte, die zum Klonieren eines menschlichen Gens in Bakterien nötig sind, in die richtige Reihenfolge und begründen Sie diese: das rekombinante Plasmid in das Bakterium einbringen, das Gen und das Plasmid mit demselben Restriktionsenzym schneiden, das Gen mit DNA-Ligase mit dem Plasmid verbinden, die transformierten Bakterien selektieren und vermehren.

Eine Forschungsgruppe möchte das Peptidhormon Insulin im Bakterium Escherichia coli herstellen. Dazu isoliert sie das Insulingen direkt aus der Kern-DNA menschlicher Bauchspeicheldrüsenzellen und fügt es zusammen mit einem effizienten E.-coli-Promotor in ein bakterielles Plasmid ein.

1. a) Nach dem Einbringen des Plasmids in die Bakterien stellen sie fest, dass ein fehlerhaftes, inaktives Polypeptid mit falscher Größe gebildet wird. Erklären Sie, warum eukaryotische genomische DNA in einem Bakterium nicht korrekt exprimiert werden kann, und beziehen Sie sich dabei auf die Struktur des Gens und die Prozessierungsmaschinerie der RNA.
2. b) Entwerfen Sie die biotechnologische Strategie zur Lösung dieses Problems: Geben Sie an, welches Molekül Sie als ursprüngliche Matrize isolieren müssen, welche Art von spezifischem synthetischem Primer Sie unter Ausnutzung einer posttranskriptionalen Modifikation dieses Moleküls verwenden würden und welches Enzym viralen Ursprungs Sie zur Synthese des ersten Strangs der komplementären DNA (cDNA) einsetzen werden.
3. c) Beim Vergleich der Sequenz der erhaltenen cDNA mit der des ursprünglichen Kerngens stellt man fest, dass die cDNA viel kürzer ist und die ursprüngliche menschliche Promotorsequenz fehlt. Erklären Sie, warum das so ist, und begründen Sie, wie erreicht wird, dass das Bakterium diese cDNA nach der Klonierung in das Plasmid transkribiert.

Mit CRISPR-Cas9 lässt sich das Genom sehr präzise verändern. Erklären Sie in einfachen Worten, welche Funktion die Guide-RNA und welche Funktion das Protein Cas9 bei dieser Methode hat.