A replicação do ADN

Durante a replicação, que nucleótido será inserido em frente a uma adenina da cadeia molde? E em frente a uma guanina? Explica que propriedade da estrutura do ADN permite que a cópia seja fiel.

A análise química do ADN de uma espécie mostra que $30\ \%$ das suas bases correspondem a adenina. Indica, fundamentando, as percentagens de timina, guanina e citosina, e explica que consequência tem esta relação de complementaridade para a replicação do ADN.

O que significa que a replicação do ADN é semiconservativa? Explica por palavras tuas, indicando como ficam formadas as duas moléculas de ADN filhas.

Em que momento do ciclo celular se replica o ADN e por que razão é indispensável que a replicação ocorra antes de se iniciar a divisão celular?

Antes da célebre experiência de Meselson e Stahl existiam três modelos teóricos para explicar a replicação do ADN: semiconservativo, conservativo e dispersivo. Imagina que realizas esta experiência cultivando bactérias E. coli durante muitas gerações num meio com azoto pesado ($^{15}\text{N}$) até que todo o seu ADN esteja marcado, e depois transferes-las para um meio com azoto leve ($^{14}\text{N}$).

1. a) Deduz que tipos de moléculas de ADN (pesadas $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbridas $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ ou leves $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) e em que percentagens apareceriam no gradiente de densidade após uma e após duas gerações se a replicação fosse:

1. Estritamente conservativa.

2. Estritamente dispersiva.

1. b) Explica de forma fundamentada qual destes dois modelos alternativos ficou descartado logo com a análise do ADN da primeira geração e qual exigiu obrigatoriamente esperar pela segunda geração para ser refutado.

Indica o nome da enzima principal que sintetiza a nova cadeia de ADN durante a replicação, explica qual é a sua função básica e em que sentido (5'→3' ou 3'→5') adiciona os nucleótidos.

Indica o nome da enzima que abre a dupla hélice de ADN na forquilha de replicação e explica que problema mecânico surge na molécula à frente da forquilha (superenrolamento) e que tipo de enzima o resolve.

Explica o papel do iniciador (ou primer) de ARN no início da replicação e justifica por que razão a ADN polimerase não consegue iniciar uma nova cadeia a partir do zero.

Numa forquilha de replicação, uma das novas cadeias (A) é sintetizada de forma contínua avançando em direção à forquilha, enquanto a outra (B) é sintetizada em fragmentos afastando-se dela. Indica qual das novas cadeias (A ou B) é a cadeia condutora e qual é a cadeia atrasada, e explica por que razão uma é sintetizada de forma contínua e a outra em fragmentos de Okazaki, fazendo referência ao sentido em que a ADN polimerase atua.

Indica o nome da enzima que sintetiza os iniciadores de ARN durante a replicação e explica por que razão cada fragmento de Okazaki necessita do seu próprio iniciador, enquanto a cadeia contínua apenas necessita de um no início.

Após a remoção dos iniciadores de ARN da cadeia descontínua, com que material são preenchidos os espaços vazios e que enzima sela depois a cadeia? Explica por que razão a cadeia descontínua demora mais tempo a completar-se do que a cadeia contínua.

Os nucleótidos incorporados na nova cadeia chegam sob a forma de trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Explica de onde obtém a célula a energia necessária para formar as ligações da cadeia em crescimento.

Ordena as seguintes etapas da replicação e justifica a ordem escolhida: ligação dos fragmentos pela ADN ligase, abertura da dupla hélice pela helicase, síntese de nucleótidos pela ADN polimerase, remoção dos iniciadores, formação dos fragmentos de Okazaki.

Para analisar a síntese das novas cadeias de ADN durante a replicação, realiza-se um ensaio de pulso e perseguição (pulse-chase) numa cultura bacteriana: as células são expostas a timidina radioativa ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) durante um pulso ultracurto de $5$ segundos e depois são transferidas para um meio com timidina não radioativa em excesso (perseguição) durante $5$ minutos. Após lise e desnaturação alcalina, as cadeias de ADN são separadas por gradiente de densidade em centrífuga. a) Prevê e justifica que padrão de tamanhos de fragmentos radioativos (pequenos de cerca de $1000$-$2000$ nucleótidos ou de elevado peso molecular) se observará no final do pulso ($5$ s) e como mudará após a perseguição ($5$ min). b) Se o mesmo ensaio for realizado numa estirpe mutante com a ADN ligase bloqueada termicamente, prevê o resultado após os $5$ minutos de perseguição e justifica a tua resposta. c) Justifica por que razão esta experiência refuta a hipótese de que ambas as cadeias se sintetizem de forma contínua.

Num laboratório obtém-se uma estirpe mutante de Escherichia coli que apresenta uma alteração na ADN polimerase III: mantém intacta a sua velocidade de polimerização no sentido $5'\to 3'$, mas perdeu completamente a sua atividade exonucleásica $3'\to 5'$. a) Prevê e justifica que efeito terá esta mutação sobre a fidelidade de cópia e sobre a taxa de mutações espontâneas por divisão celular. b) Se esta estirpe for cultivada na presença de 2-aminopurina (um análogo de base que pode emparelhar incorretamente com a citosina), deduz se a taxa de fixação de mutações será maior, menor ou igual à da estirpe selvagem. c) Justifica molecularmente por que razão a atividade de revisão de provas deve remover o nucleótido erróneo na direção $3'\to 5'$ antes de continuar com a adição do nucleótido seguinte.

A replicação do ADN alcança uma fidelidade extraordinária graças a três barreiras sucessivas: a especificidade de emparelhamento da ADN polimerase (erro de $1$ em cada $10^5$ nucleótidos), a correção de provas exonucleásica $3'\to 5'$ (erro final de $1$ em cada $10^7$) e o sistema pós-replicativo de reparação de emparelhamentos incorretos (mismatch repair, erro final de $1$ em cada $10^9$). a) Uma linha celular de cancro colorretal hereditário (síndrome de Lynch) apresenta uma taxa de mutação $100$ vezes superior ao normal, apesar de as suas ADN polimerases terem as atividades polimerásica e exonucleásica intactas. Deduz e justifica que mecanismo está a falhar nestas células. b) Para corrigir um erro após a passagem da forquilha, o sistema de reparação deve distinguir a cadeia molde (antiga) da recém-sintetizada. Justifica como a maquinaria celular consegue discriminar ambas as cadeias para evitar substituir a base da cadeia original. c) Se um erro de emparelhamento (por exemplo, uma guanina incorretamente emparelhada com uma timina) escapar a todos os sistemas de correção e a célula passar por dois ciclos completos de divisão celular, deduz que proporção das moléculas de ADN filhas finais portará a mutação já fixada de forma permanente.

Quantas forquilhas de replicação se formam a partir de uma única origem de replicação e em que sentido avançam? Explica que vantagem representa o facto de os cromossomas eucarióticos possuírem múltiplas origens de replicação.

Indica duas diferenças entre a replicação de um cromossoma bacteriano e a de um cromossoma humano, tendo em conta a forma do ADN e o número de origens de replicação.

O ADN polimerase de E. coli adiciona cerca de $1000$ nucleótidos por segundo em cada forquilha. Calcula quanto tempo demorará, no mínimo, a replicar o seu cromossoma circular de $4,6$ milhões de pares de bases se este se replicar a partir de uma única origem de forma bidirecional, e comenta o resultado comparando-o com o tempo de geração da bactéria (cerca de $20$ minutos).

Comparam-se no laboratório duas culturas celulares humanas: fibroblastos dérmicos normais e células cancerosas de uma linha celular de carcinoma pulmonar. Ao longo de $60$ duplicações populacionais monitoriza-se o comprimento médio dos telómeros. Os fibroblastos entram em senescência replicativa na duplicação $40$ com um encurtamento telomérico progressivo, enquanto as células cancerosas proliferam de forma contínua e mantêm intacto o comprimento dos seus telómeros. a) Justifica molecularmente por que razão a maquinaria convencional de replicação não consegue completar a extremidade $5'$ da cadeia atrasada após a remoção do último iniciador de ARN (o «problema da extremidade»). b) Desenha-se uma terapia que introduz nas células tumorais um oligonucleótido sintético complementar ao ARN molde da ribonucleoproteína telomerase humana (hTR). Prevê e justifica que efeito terá este tratamento sobre a atividade da telomerase, o comprimento dos telómeros e a viabilidade a longo prazo das células tumorais.

Após a replicação, cada cromossoma fica constituído por dois cromatídeos-irmãos. Explica que relação existe entre as sequências de ADN de ambos os cromatídeos, por que razão permanecem unidos durante algum tempo e em que momento da divisão celular se separam.

Isola-se um mutante termossensível de levedura para o gene que codifica a ADN ligase I. A $25\text{ }^\circ\text{C}$ a levedura divide-se normalmente, mas ao cultivá-la a $37\text{ }^\circ\text{C}$ a enzima inativa-se e a célula interrompe o seu ciclo celular antes de entrar em mitose. a) Um aluno afirma: «A $37\text{ }^\circ\text{C}$, apenas a cadeia atrasada apresentará quebras porque é nela que se formam os fragmentos de Okazaki; a cadeia condutora será uma única cadeia perfeitamente contínua de uma ponta à outra do cromossoma». Rebate esta afirmação tendo em conta a presença de múltiplas origens de replicação (replicões) por cromossoma linear. b) Especifica o tipo exato de ligação química que não se pode formar na ausência de ligase (indicando os grupos químicos terminais $3'$ e $5'$) e justifica por que razão as ADN polimerases não conseguem realizar esta reação de junção por si sós. c) Justifica por que razão a presença de quebras não seladas na dupla hélice ativa um ponto de controlo do ciclo celular impedindo a mitose.

Para comprovar se a replicação é contínua ou descontínua, uns investigadores realizam uma marcação com timidina tritiada durante pulsos de $5$, $15$ e $60$ segundos em bactérias. Após desnaturarem o ADN, analisam o tamanho das cadeias radioativas por centrifugação. Aos $5$ segundos apenas detetam fragmentos curtos ($1000$-$2000$ nucleótidos), mas à medida que o tempo de marcação aumenta, a radioatividade desloca-se progressivamente para fragmentos de grande tamanho molecular. a) Justifica por que razão este resultado apoia que a replicação ocorre de forma semidescontínua e não contínua em ambas as cadeias. b) Prevê e justifica que resultado teria sido obtido nas três medições se ambas as cadeias fossem sintetizadas de forma contínua a partir da origem de replicação. c) Explica a causa molecular obrigatória (estrutural e enzimática) pela qual a célula se vê forçada a sintetizar uma das duas cadeias à base de pequenos fragmentos.