La replicación del ADN

¿Qué significa que la replicación del ADN es semiconservadora? Explícalo con tus propias palabras, indicando cómo quedan formadas las dos moléculas de ADN hijas.

¿En qué momento del ciclo celular se replica el ADN y por qué es imprescindible que la replicación ocurra antes de que comience la división celular?

Antes del célebre experimento de Meselson y Stahl existían tres modelos teóricos para explicar la duplicación del ADN: semiconservativo, conservativo y dispersivo. Imagina que realizas este experimento cultivando bacterias E. coli durante muchas generaciones en un medio con nitrógeno pesado ($^{15}\text{N}$) hasta que todo su ADN esté marcado, y luego las transfieres a un medio con nitrógeno ligero ($^{14}\text{N}$).

1. a) Deduce qué tipos de moléculas de ADN (pesadas $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbridas $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ o ligeras $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) y en qué porcentajes aparecerían en el gradiente de densidad tras una y tras dos generaciones si la replicación fuera:

1. Estrictamente conservativa.

2. Estrictamente dispersiva.

1. b) Razona de forma justificada cuál de estos dos modelos alternativos quedó descartado ya con el análisis del ADN de la primera generación y cuál exigió obligatoriamente esperar a la segunda generación para ser refutado.

Nombra la enzima principal que sintetiza la nueva hebra de ADN durante la replicación y explica cuál es su función básica y en qué sentido (5'→3' o 3'→5') añade los nucleótidos.

Nombra la enzima que abre la doble hélice de ADN en la horquilla de replicación y explica qué problema mecánico aparece en la molécula por delante de la horquilla (superenrollamiento) y qué tipo de enzima lo resuelve.

Explica el papel del cebador (o primer) de ARN al comienzo de la replicación y razona por qué la ADN polimerasa no puede iniciar una hebra nueva desde cero.

En una horquilla de replicación, una de las hebras nuevas (A) se sintetiza de forma continua avanzando hacia la horquilla, mientras que la otra (B) se sintetiza en fragmentos alejándose de ella. Indica cuál de las hebras nuevas (A o B) es la conductora y cuál la rezagada, y explica por qué una se sintetiza de forma continua y la otra en fragmentos de Okazaki, haciendo referencia al sentido en que actúa la ADN polimerasa.

Ordena las siguientes etapas de la replicación y justifica el orden elegido: unión de los fragmentos por la ADN ligasa, apertura de la doble hélice por la helicasa, síntesis de nucleótidos por la ADN polimerasa, eliminación de los cebadores, formación de los fragmentos de Okazaki.

Nombra la enzima que sintetiza los cebadores de ARN durante la replicación y explica por qué cada fragmento de Okazaki necesita su propio cebador mientras que la hebra conductora solo necesita uno al comienzo.

Una vez eliminados los cebadores de ARN de la hebra rezagada, ¿con qué se rellenan los huecos y qué enzima sella después la cadena? Explica por qué la hebra rezagada tarda más en completarse que la conductora.

Para analizar la síntesis de las nuevas hebras de ADN durante la replicación, se realiza un ensayo de pulso y caza en un cultivo bacteriano: las células se exponen a timidina radiactiva ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) durante un pulso ultracorto de $5$ segundos y después se transfieren a un medio con timidina no radiactiva en exceso (caza) durante $5$ minutos. Tras lisis y desnaturalización alcalina, las cadenas de ADN se separan por gradiente de densidad en centrífuga. a) Predice y justifica qué patrón de tamaños de fragmentos radiactivos (pequeños de unos $1000$-$2000$ nucleótidos o de gran peso molecular) se observará al término del pulso ($5$ s) y cómo cambiará tras la caza ($5$ min). b) Si el mismo ensayo se realiza en una cepa mutante con la ADN ligasa bloqueada térmicamente, predice el resultado tras los $5$ minutos de caza y justifica tu respuesta. c) Razona por qué este experimento refuta la hipótesis de que ambas hebras se sinteticen de manera continua.

Durante la replicación, ¿qué nucleótido se insertará frente a una adenina de la hebra molde? ¿Y frente a una guanina? Explica qué propiedad de la estructura del ADN hace posible que la copia sea fiel.

Los nucleótidos que se incorporan a la nueva hebra llegan como trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Explica de dónde obtiene la célula la energía necesaria para formar los enlaces de la cadena en crecimiento.

El análisis químico del ADN de una especie muestra que el $30\ \%$ de sus bases es adenina. Indica, razonándolo, los porcentajes de timina, guanina y citosina, y explica qué consecuencia tiene esta relación de complementariedad para la replicación del ADN.

En un laboratorio se obtiene una cepa mutante de Escherichia coli que presenta una alteración en la ADN polimerasa III: mantiene intacta su velocidad de polimerización en sentido $5'\to 3'$, pero ha perdido completamente su actividad exonucleasa $3'\to 5'$. a) Predice y justifica qué efecto tendrá esta mutación sobre la fidelidad de copia y sobre la tasa de mutaciones espontáneas por división celular. b) Si se cultiva esta cepa en presencia de 2-aminopurina (un análogo de base que puede aparear incorrectamente con la citosina), razona si la tasa de fijación de mutaciones será mayor, menor o igual que en la cepa silvestre. c) Justifica molecularmente por qué la actividad correctora de pruebas debe retirar el nucleótido erróneo en dirección $3'\to 5'$ antes de continuar con la adición del siguiente nucleótido.

La replicación del ADN alcanza una fidelidad extraordinaria gracias a tres barreras sucesivas: la especificidad de apareamiento de la ADN polimerasa (error de $1$ cada $10^5$ nucleótidos), la corrección de pruebas exonucleasa $3'\to 5'$ (error final de $1$ cada $10^7$) y el sistema posreplicativo de reparación de apareamientos incorrectos (mismatch repair, error final de $1$ cada $10^9$). a) Una estirpe celular de cáncer colorrectal hereditario (síndrome de Lynch) presenta una tasa de mutación $100$ veces superior a la normal, pese a que sus ADN polimerasas tienen actividades polimerasa y exonucleasa intactas. Deduce y justifica qué mecanismo está fallando en estas células. b) Para corregir un error tras el paso de la horquilla, el sistema de reparación debe distinguir la hebra molde (antigua) de la recién sintetizada. Razona cómo logra la maquinaria celular discriminar ambas hebras para evitar sustituir la base de la hebra original. c) Si un error de apareamiento (por ejemplo, una guanina enfrentada incorrectamente a una timina) escapa a todos los sistemas de corrección y la célula pasa por dos ciclos completos de división celular, deduce qué proporción de las moléculas de ADN hijas finales portará la mutación ya fijada de forma permanente.

¿Cuántas horquillas de replicación se forman a partir de un único origen de replicación y en qué sentido avanzan? Explica qué ventaja supone que los cromosomas eucariotas tengan muchos orígenes de replicación.

Indica dos diferencias entre la replicación de un cromosoma bacteriano y la de un cromosoma humano, atendiendo a la forma del ADN y al número de orígenes de replicación.

La ADN polimerasa de E. coli añade unos $1000$ nucleótidos por segundo en cada horquilla. Calcula cuánto tiempo tardará, como mínimo, en replicarse su cromosoma circular de $4.6$ millones de pares de bases si se replica desde un único origen de forma bidireccional, y comenta el resultado comparándolo con el tiempo de generación de la bacteria (unos $20$ minutos).

Tras la replicación, cada cromosoma queda formado por dos cromátidas hermanas. Explica qué relación guardan las secuencias de ADN de ambas cromátidas, por qué permanecen unidas durante un tiempo y en qué momento de la división celular se separan.

Se comparan en el laboratorio dos cultivos celulares humanos: fibroblastos dérmicos normales y células cancerosas de una estirpe de carcinoma pulmonar. A lo largo de $60$ duplicaciones poblacionales se monitoriza la longitud media de los telómeros. Los fibroblastos entran en senescencia replicativa en la duplicación $40$ con un acortamiento telomérico progresivo, mientras que las células cancerosas proliferan de forma continua y mantienen intacta la longitud de sus telómeros. a) Justifica molecularmente por qué la maquinaria convencional de replicación no puede completar el extremo $5'$ de la hebra rezagada tras la eliminación del último cebador de ARN (el «problema del extremo»). b) Se diseña una terapia que introduce en las células tumorales un oligonucleótido sintético complementario al ARN molde de la ribonucleoproteína telomerasa humana (hTR). Predice y justifica qué efecto tendrá este tratamiento sobre la actividad de la telomerasa, la longitud de los telómeros y la viabilidad a largo plazo de las células tumorales.

En embriones tempranos del insecto Drosophila melanogaster, la fase S dura solo $5$ minutos, mientras que en las células somáticas adultas se prolonga durante unas $8$ horas. Sin embargo, la velocidad de avance de la horquilla de replicación es idéntica en ambos estadios: unos $40$ nucleótidos por segundo. a) Si el genoma haploide de Drosophila tiene $1.8 \times 10^8$ pares de bases, calcula la distancia media máxima (en pares de bases) que puede haber entre dos orígenes de replicación activos adyacentes en el embrión para completar la replicación en $5$ minutos, asumiendo replicación bidireccional. b) Interpreta a qué se debe la diferencia en la duración de la fase S entre el embrión y el adulto si la velocidad de polimerización no cambia. c) Razona qué riesgo genómico supondría para la célula eucariota que un mismo origen de replicación volviera a activarse («dispararse») dos veces dentro de una misma fase S y cómo previene la célula este suceso.

Se aísla un mutante termosensible de levadura para el gen que codifica la ADN ligasa I. A $25\text{ }^\circ\text{C}$ la levadura se divide normalmente, pero al cultivarla a $37\text{ }^\circ\text{C}$ la enzima se inactiva y la célula detiene su ciclo celular antes de entrar en mitosis. a) Un alumno afirma: «A $37\text{ }^\circ\text{C}$, solo la hebra rezagada presentará roturas porque en ella se forman los fragmentos de Okazaki; la hebra conductora será una única cadena perfectamente continua de un extremo al otro del cromosoma». Rebate esta afirmación teniendo en cuenta la presencia de múltiples orígenes de replicación (replicones) por cromosoma lineal. b) Especifica el tipo exacto de enlace químico que no se puede sellar en ausencia de ligasa (indicando los grupos químicos terminales $3'$ y $5'$) y razona por qué las ADN polimerasas no pueden llevar a cabo esta reacción de sellado por sí solas. c) Justifica por qué la presencia de roturas no selladas en la doble hélice activa un punto de control del ciclo celular impidiendo la mitosis.

Para comprobar si la replicación es continua o discontinua, unos investigadores realizan un marcaje con timidina tritiada durante pulsos de $5$, $15$ y $60$ segundos en bacterias. Tras desnaturalizar el ADN, analizan el tamaño de las cadenas radiactivas por centrifugación. A los $5$ segundos solo detectan fragmentos cortos ($1000$-$2000$ nucleótidos), pero conforme el tiempo de marcaje aumenta, la radiactividad se desplaza progresivamente hacia fragmentos de gran tamaño molecular. a) Razona por qué este resultado apoya que la replicación se produce de forma semidiscontinua y no continua en ambas hebras. b) Predice y justifica qué resultado se habría obtenido en las tres mediciones si ambas hebras se sintetizaran de forma continua a partir del origen de replicación. c) Explica la causa molecular obligada (estructural y enzimática) por la cual la célula se ve forzada a sintetizar una de las dos hebras a base de pequeños fragmentos.