La replicació de l'ADN

Què significa que la replicació de l'ADN és semiconservadora? Explica-ho amb les teves paraules, indicant com queden formades les dues molècules d'ADN filles.

Abans del cèlebre experiment de Meselson i Stahl existien tres models teòrics per explicar la duplicació de l'ADN: semiconservatiu, conservatiu i dispersiu. Imagina que realitzes aquest experiment cultivant bacteris E. coli durant moltes generacions en un medi amb nitrogen pesant ($^{15}\text{N}$) fins que tot el seu ADN estigui marcat, i després les transfereixes a un medi amb nitrogen lleuger ($^{14}\text{N}$).

1. a) Dedueix quins tipus de molècules d'ADN (pesants $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbrides $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ o lleugeres $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) i en quins percentatges apareixerien en el gradient de densitat després d'una i després de dues generacions si la replicació fos:

1. Estrictament conservativa.

2. Estrictament dispersiva.

1. b) Raona de manera justificada quin d'aquests dos models alternatius va quedar descartat ja amb l'anàlisi de l'ADN de la primera generació i quin va exigir obligatòriament esperar a la segona generació per ser refutat.

Anomena l'enzim principal que sintetitza el nou filament d'ADN durant la replicació i explica quina és la seva funció bàsica i en quin sentit (5'→3' o 3'→5') afegeix els nucleòtids.

Anomena l'enzim que obre la doble hèlix d'ADN a la forqueta de replicació i explica quin problema mecànic apareix a la molècula per davant de la forqueta (superenrotllament) i quin tipus d'enzim el resol.

Explica el paper del cebador (o primer) d'ARN al començament de la replicació i raona per què l'ADN polimerasa no pot iniciar un filament nou des de zero.

En una forqueta de replicació, un dels filaments nous (A) se sintetitza de manera contínua avançant cap a la forqueta, mentre que l'altre (B) se sintetitza en fragments allunyant-se'n. Indica quin dels filaments nous (A o B) és el conductor i quin el retardat, i explica per què un se sintetitza de manera contínua i l'altre en fragments d'Okazaki, fent referència al sentit en què actua l'ADN polimerasa.

Anomena l'enzim que sintetitza els cebadors d'ARN durant la replicació i explica per què cada fragment d'Okazaki necessita el seu propi cebador mentre que el filament conductor només en necessita un al començament.

Un cop eliminats els cebadors d'ARN del filament retardat, amb què s'omplen els buits i quin enzim segella després la cadena? Explica per què el filament retardat triga més a completar-se que el conductor.

Durant la replicació, quin nucleòtid s'inserirà enfront d'una adenina del filament motlle? I enfront d'una guanina? Explica quina propietat de l'estructura de l'ADN fa possible que la còpia sigui fidel.

En un laboratori s'obté un cep mutant d'Escherichia coli que presenta una alteració en l'ADN polimerasa III: manté intacta la seva velocitat de polimerització en sentit $5'\to 3'$, però ha perdut completament la seva activitat exonucleasa $3'\to 5'$. a) Prediu i justifica quin efecte tindrà aquesta mutació sobre la fidelitat de còpia i sobre la taxa de mutacions espontànies per divisió cel·lular. b) Si es cultiva aquest cep en presència de 2-aminopurina (un anàleg de base que pot aparellar incorrectament amb la citosina), raona si la taxa de fixació de mutacions serà més alta, més baixa o igual que en el cep silvestre. c) Justifica molecularment per què l'activitat correctora de proves ha de retirar el nucleòtid erroni en direcció $3'\to 5'$ abans de continuar amb l'addició del nucleòtid següent.

La replicació de l'ADN assoleix una fidelitat extraordinària gràcies a tres barreres successives: l'especificitat d'aparellament de l'ADN polimerasa (error d'$1$ cada $10^5$ nucleòtids), la correcció de proves exonucleasa $3'\to 5'$ (error final d'$1$ cada $10^7$) i el sistema postreplicatiu de reparació d'aparellaments incorrectes (mismatch repair, error final d'$1$ cada $10^9$). a) Una estirp cel·lular de càncer colorectal hereditari (síndrome de Lynch) presenta una taxa de mutació $100$ vegades superior a la normal, malgrat que les seves ADN polimerases tenen activitats polimerasa i exonucleasa intactes. Dedueix i justifica quin mecanisme està fallant en aquestes cèl·lules. b) Per corregir un error després del pas de la forqueta, el sistema de reparació ha de distingir el filament motlle (antic) del que s'acaba de sintetitzar. Raona com aconsegueix la maquinària cel·lular discriminar ambdós filaments per evitar substituir la base del filament original. c) Si un error d'aparellament (per exemple, una guanina enfrontada incorrectament a una timina) escapa a tots els sistemes de correcció i la cèl·lula passa per dos cicles complets de divisió cel·lular, dedueix quina proporció de les molècules d'ADN filles finals portarà la mutació ja fixada de manera permanent.

Quantes forquetes de replicació es formen a partir d'un únic origen de replicació i en quin sentit avancen? Explica quin avantatge suposa que els cromosomes eucariotes tinguin molts orígens de replicació.

Es comparen al laboratori dos cultius cel·lulars humans: fibroblasts dèrmics normals i cèl·lules canceroses d'una estirp de carcinoma pulmonar. Al llarg de $60$ duplicacions poblacionals es monitora la longitud mitjana dels telòmers. Els fibroblasts entren en senescència replicativa a la duplicació $40$ amb un escurçament telomèric progressiu, mentre que les cèl·lules canceroses proliferen de manera contínua i mantenen intacta la longitud dels seus telòmers. a) Justifica molecularment per què la maquinària convencional de replicació no pot completar l'extrem $5'$ del filament retardat després de l'eliminació de l'últim encebador d'ARN (el «problema de l'extrem»). b) Es dissenya una teràpia que introdueix a les cèl·lules tumorals un oligonucleòtid sintètic complementari a l'ARN motlle de la ribonucleoproteïna telomerasa humana (hTR). Prediu i justifica quin efecte tindrà aquest tractament sobre l'activitat de la telomerasa, la longitud dels telòmers i la viabilitat a llarg termini de les cèl·lules tumorals.

En embrions primerencs de l'insecte Drosophila melanogaster, la fase S dura només $5$ minuts, mentre que a les cèl·lules somàtiques adultes es perllonga durant unes $8$ hores. Tanmateix, la velocitat d'avanç de la forqueta de replicació és idèntica en ambdós estadis: uns $40$ nucleòtids per segon. a) Si el genoma haploide de Drosophila té $1,8 \cdot 10^8$ parells de bases, calcula la distància mitjana màxima (en parells de bases) que hi pot haver entre dos orígens de replicació actius adjacents a l'embrió per completar la replicació en $5$ minuts, assumint replicació bidireccional. b) Interpreta a què es deu la diferència en la durada de la fase S entre l'embrió i l'adult si la velocitat de polimerització no canvia. c) Raona quin risc genòmic suposaria per a la cèl·lula eucariota que un mateix origen de replicació tornés a activar-se («disparar-se») dues vegades dins d'una mateixa fase S i com prevé la cèl·lula aquest esdeveniment.