Exercicis: La replicació de l'ADN

Què significa que la replicació de l'ADN és semiconservadora? Explica-ho amb les teves paraules, indicant com queden formades les dues molècules d'ADN filles.

Anomena l'enzim principal que sintetitza el nou filament d'ADN durant la replicació i explica quina és la seva funció bàsica i en quin sentit (5'→3' o 3'→5') afegeix els nucleòtids.

En quin moment del cicle cel·lular es replica l'ADN i per què és imprescindible que la replicació tingui lloc abans que comenci la divisió cel·lular?

Anomena l'enzim que obre la doble hèlix d'ADN a la forqueta de replicació i explica quin problema mecànic apareix a la molècula per davant de la forqueta (superenrotllament) i quin tipus d'enzim el resol.

Quantes forquetes de replicació es formen a partir d'un únic origen de replicació i en quin sentit avancen? Explica quin avantatge suposa que els cromosomes eucariotes tinguin molts orígens de replicació.

Durant la replicació, quin nucleòtid s'inserirà enfront d'una adenina del filament motlle? I enfront d'una guanina? Explica quina propietat de l'estructura de l'ADN fa possible que la còpia sigui fidel.

Indica dues diferències entre la replicació d'un cromosoma bacterià i la d'un cromosoma humà, atenent a la forma de l'ADN i al nombre d'orígens de replicació.

Els nucleòtids que s'incorporen al nou filament arriben com a trifosfats (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Explica d'on obté la cèl·lula l'energia necessària per formar els enllaços de la cadena en creixement.

Explica el paper del cebador (o primer) d'ARN al començament de la replicació i raona per què l'ADN polimerasa no pot iniciar un filament nou des de zero.

En una forqueta de replicació, un dels filaments nous (A) se sintetitza de manera contínua avançant cap a la forqueta, mentre que l'altre (B) se sintetitza en fragments allunyant-se'n. Indica quin dels filaments nous (A o B) és el conductor i quin el retardat, i explica per què un se sintetitza de manera contínua i l'altre en fragments d'Okazaki, fent referència al sentit en què actua l'ADN polimerasa.

Ordena les etapes següents de la replicació i justifica l'ordre triat: unió dels fragments per l'ADN lligasa, obertura de la doble hèlix per l'helicasa, síntesi de nucleòtids per l'ADN polimerasa, eliminació dels cebadors, formació dels fragments d'Okazaki.

Anomena l'enzim que sintetitza els cebadors d'ARN durant la replicació i explica per què cada fragment d'Okazaki necessita el seu propi cebador mentre que el filament conductor només en necessita un al començament.

Un cop eliminats els cebadors d'ARN del filament retardat, amb què s'omplen els buits i quin enzim segella després la cadena? Explica per què el filament retardat triga més a completar-se que el conductor.

L'anàlisi química de l'ADN d'una espècie mostra que el $30\ \%$ de les seves bases és adenina. Indica, raonant-ho, els percentatges de timina, guanina i citosina, i explica quina conseqüència té aquesta relació de complementarietat per a la replicació de l'ADN.

L'ADN polimerasa d'E. coli afegeix uns $1000$ nucleòtids per segon a cada forqueta. Calcula quant de temps trigarà, com a mínim, a replicar-se el seu cromosoma circular de $4,6$ milions de parells de bases si es replica des d'un únic origen de manera bidireccional, i comenta el resultat comparant-lo amb el temps de generació del bacteri (uns $20$ minuts).

Després de la replicació, cada cromosoma queda format per dues cromàtides germanes. Explica quina relació tenen les seqüències d'ADN d'ambdues cromàtides, per què romanen unides durant un temps i en quin moment de la divisió cel·lular se separen.

Abans del cèlebre experiment de Meselson i Stahl existien tres models teòrics per explicar la duplicació de l'ADN: semiconservatiu, conservatiu i dispersiu. Imagina que realitzes aquest experiment cultivant bacteris E. coli durant moltes generacions en un medi amb nitrogen pesant ($^{15}\text{N}$) fins que tot el seu ADN estigui marcat, i després les transfereixes a un medi amb nitrogen lleuger ($^{14}\text{N}$).

1. a) Dedueix quins tipus de molècules d'ADN (pesants $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbrides $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ o lleugeres $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) i en quins percentatges apareixerien en el gradient de densitat després d'una i després de dues generacions si la replicació fos:

1. Estrictament conservativa.

2. Estrictament dispersiva.

1. b) Raona de manera justificada quin d'aquests dos models alternatius va quedar descartat ja amb l'anàlisi de l'ADN de la primera generació i quin va exigir obligatòriament esperar a la segona generació per ser refutat.

En un laboratori s'obté un cep mutant d'Escherichia coli que presenta una alteració en l'ADN polimerasa III: manté intacta la seva velocitat de polimerització en sentit $5'\to 3'$, però ha perdut completament la seva activitat exonucleasa $3'\to 5'$. a) Prediu i justifica quin efecte tindrà aquesta mutació sobre la fidelitat de còpia i sobre la taxa de mutacions espontànies per divisió cel·lular. b) Si es cultiva aquest cep en presència de 2-aminopurina (un anàleg de base que pot aparellar incorrectament amb la citosina), raona si la taxa de fixació de mutacions serà més alta, més baixa o igual que en el cep silvestre. c) Justifica molecularment per què l'activitat correctora de proves ha de retirar el nucleòtid erroni en direcció $3'\to 5'$ abans de continuar amb l'addició del nucleòtid següent.

Es comparen al laboratori dos cultius cel·lulars humans: fibroblasts dèrmics normals i cèl·lules canceroses d'una estirp de carcinoma pulmonar. Al llarg de $60$ duplicacions poblacionals es monitora la longitud mitjana dels telòmers. Els fibroblasts entren en senescència replicativa a la duplicació $40$ amb un escurçament telomèric progressiu, mentre que les cèl·lules canceroses proliferen de manera contínua i mantenen intacta la longitud dels seus telòmers. a) Justifica molecularment per què la maquinària convencional de replicació no pot completar l'extrem $5'$ del filament retardat després de l'eliminació de l'últim encebador d'ARN (el «problema de l'extrem»). b) Es dissenya una teràpia que introdueix a les cèl·lules tumorals un oligonucleòtid sintètic complementari a l'ARN motlle de la ribonucleoproteïna telomerasa humana (hTR). Prediu i justifica quin efecte tindrà aquest tractament sobre l'activitat de la telomerasa, la longitud dels telòmers i la viabilitat a llarg termini de les cèl·lules tumorals.

Per analitzar la síntesi dels nous filaments d'ADN durant la replicació, es realitza un assaig de pols i caça en un cultiu bacterià: les cèl·lules s'exposen a timidina radioactiva ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) durant un pols ultracurt de $5$ segons i després es transfereixen a un medi amb timidina no radioactiva en excés (caça) durant $5$ minuts. Després de la lisi i la desnaturalització alcalina, les cadenes d'ADN se separen per gradient de densitat en centrífuga. a) Prediu i justifica quin patró de mides de fragments radioactius (petits d'uns $1000$-$2000$ nucleòtids o de gran pes molecular) s'observarà en acabar el pols ($5$ s) i com canviarà després de la caça ($5$ min). b) Si el mateix assaig es realitza en un cep mutant amb l'ADN lligasa bloquejada tèrmicament, prediu el resultat després dels $5$ minuts de caça i justifica la teva resposta. c) Raona per què aquest experiment refuta la hipòtesi que ambdós filaments se sintetitzin de manera contínua.

S'aïlla un mutant termosensible de llevat per al gen que codifica l'ADN lligasa I. A $25\text{ }^\circ\text{C}$ el llevat es divideix normalment, però en cultivar-lo a $37\text{ }^\circ\text{C}$ l'enzim s'inactiva i la cèl·lula atura el seu cicle cel·lular abans d'entrar en mitosi. a) Un alumne afirma: «A $37\text{ }^\circ\text{C}$, només el filament retardat presentarà trencaments perquè és on es formen els fragments d'Okazaki; el filament conductor serà una única cadena perfectament contínua d'un extrem a l'altre del cromosoma». Rebat aquesta afirmació tenint en compte la presència de múltiples orígens de replicació (replicons) per cromosoma lineal. b) Especifica el tipus exacte d'enllaç químic que no es pot segellar en absència de lligasa (indicant els grups químics terminals $3'$ i $5'$) i raona per què les ADN polimerases no poden dur a terme aquesta reacció de segellament per si soles. c) Justifica per què la presència de trencaments no segellats a la doble hèlix activa un punt de control del cicle cel·lular impedint la mitosi.

En embrions primerencs de l'insecte Drosophila melanogaster, la fase S dura només $5$ minuts, mentre que a les cèl·lules somàtiques adultes es perllonga durant unes $8$ hores. Tanmateix, la velocitat d'avanç de la forqueta de replicació és idèntica en ambdós estadis: uns $40$ nucleòtids per segon. a) Si el genoma haploide de Drosophila té $1,8 \cdot 10^8$ parells de bases, calcula la distància mitjana màxima (en parells de bases) que hi pot haver entre dos orígens de replicació actius adjacents a l'embrió per completar la replicació en $5$ minuts, assumint replicació bidireccional. b) Interpreta a què es deu la diferència en la durada de la fase S entre l'embrió i l'adult si la velocitat de polimerització no canvia. c) Raona quin risc genòmic suposaria per a la cèl·lula eucariota que un mateix origen de replicació tornés a activar-se («disparar-se») dues vegades dins d'una mateixa fase S i com prevé la cèl·lula aquest esdeveniment.

La replicació de l'ADN assoleix una fidelitat extraordinària gràcies a tres barreres successives: l'especificitat d'aparellament de l'ADN polimerasa (error d'$1$ cada $10^5$ nucleòtids), la correcció de proves exonucleasa $3'\to 5'$ (error final d'$1$ cada $10^7$) i el sistema postreplicatiu de reparació d'aparellaments incorrectes (mismatch repair, error final d'$1$ cada $10^9$). a) Una estirp cel·lular de càncer colorectal hereditari (síndrome de Lynch) presenta una taxa de mutació $100$ vegades superior a la normal, malgrat que les seves ADN polimerases tenen activitats polimerasa i exonucleasa intactes. Dedueix i justifica quin mecanisme està fallant en aquestes cèl·lules. b) Per corregir un error després del pas de la forqueta, el sistema de reparació ha de distingir el filament motlle (antic) del que s'acaba de sintetitzar. Raona com aconsegueix la maquinària cel·lular discriminar ambdós filaments per evitar substituir la base del filament original. c) Si un error d'aparellament (per exemple, una guanina enfrontada incorrectament a una timina) escapa a tots els sistemes de correcció i la cèl·lula passa per dos cicles complets de divisió cel·lular, dedueix quina proporció de les molècules d'ADN filles finals portarà la mutació ja fixada de manera permanent.

Per comprovar si la replicació és contínua o discontínua, uns investigadors fan un marcatge amb timidina tritiada durant polsos de $5$, $15$ i $60$ segons en bacteris. Després de desnaturalitzar l'ADN, analitzen la mida de les cadenes radioactives per centrifugació. Als $5$ segons només detecten fragments curts ($1000$-$2000$ nucleòtids), però a mesura que el temps de marcatge augmenta, la算出 radioactivitat es desplaça progressivament cap a fragments de gran mida molecular. a) Raona per què aquest resultat dona suport al fet que la replicació es produeix de manera semidiscontínua i no contínua en totes dues cadenes. b) Prediu i justifica quin resultat s'hauria obtingut en els tres mesuraments si totes dues cadenes se sintetitzessin de manera contínua a partir de l'origen de replicació. c) Explica la causa molecular obligada (estructural i enzimàtica) per la qual la cèl·lula es veu forçada a sintetitzar una de les dues cadenes a base de petits fragments.