Les tècniques d'enginyeria genètica

Què és la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) i per a què s'utilitza? Anomena dues situacions pràctiques en què resulti imprescindible amplificar ADN.

L'esquema mostra un cicle de PCR amb els seus tres passos numerats i la temperatura de cadascun. Explica què passa a cada pas i raona per què cadascun requereix la seva temperatura característica.

Per amplificar per PCR un fragment d'ADN bicatenari diana, es coneix la seqüència dels extrems d'un dels seus filaments (llegida en sentit 5' $\rightarrow$ 3'):

5'-ATGCCGTAG... [fragment diana de $600\ \text{pb}$] ...ACGTTCGAT-3'

1. a) Dissenya la seqüència i la polaritat (5' $\rightarrow$ 3') dels dos encebadors d'ADN (de 9 nucleòtids cadascun) necessaris per amplificar aquesta regió. Justifica per què tots dos encebadors han de tenir seqüències diferents i orientar-se en sentits convergents.
2. b) Un estudiant programa el termociclador amb els cicles següents: $60\ \text{°C}$ (hibridació o anellament) i $72\ \text{°C}$ (elongació), ometent intencionadament el pas a $95\ \text{°C}$. Després de 30 cicles, analitza la mostra per electroforesi i no observa cap banda. Justifica a escala molecular la causa del fracàs.
3. c) Si es parteix de 2 molècules d'ADN bicatenari inicials i la reacció té una eficiència teòrica del $100\ \%$, dedueix quantes molècules bicatenàries que continguin exclusivament la longitud exacta delimitada pels encebadors s'hauran generat en completar-se el tercer cicle de la PCR. Justifica la teva resposta raonant pas a pas què passa a cada cicle.

En un laboratori es pretén amplificar un gen humà mitjançant PCR, però per error un tècnic utilitza ADN polimerasa I purificada d'Escherichia coli en lloc de la polimerasa Taq habitual de Thermus aquaticus.

1. a) Si s'aplica el programa tèrmic estàndard ($95\ \text{°C}$ durant $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ durant $30\ \text{s}$ i $72\ \text{°C}$ durant $1\ \text{min}$, repetit 30 vegades), prediu quin resultat s'obtindrà en l'electroforesi en gel d'agarosa i justifica molecularment què li passa a l'enzim d'E. coli durant el primer cicle.
2. b) Als inicis de la tècnica, abans de l'aïllament de polimerases termòfiles, la PCR es realitzava amb ADN polimerasa I d'E. coli. Dissenya la modificació del protocol experimental que havien de dur a terme els investigadors en cadascun dels 30 cicles per aconseguir l'amplificació i explica quins inconvenients pràctics plantejava.
3. c) La polimerasa Taq no té activitat exonucleasa 3' $\rightarrow$ 5', a diferència d'altres polimerases termoestables com la Pfu. Justifica quin dels dos enzims és més idoni per amplificar un gen amb finalitats terapèutiques on no es tolerin errors de seqüència, explicant la funció d'aquesta activitat enzimàtica.

Què són els enzims de restricció, de quins organismes s'obtenen i quina és la seva funció en l'enginyeria genètica?

Què és un organisme transgènic? Posa un exemple i explica, a grans trets, com s'obté.

Ordena els passos necessaris per clonar un gen humà en bacteris i justifica l'ordre: introduir el plasmidi recombinant en el bacteri, tallar el gen i el plasmidi amb el mateix enzim de restricció, unir el gen al plasmidi amb ADN ligasa, seleccionar i multiplicar els bacteris transformats.

Un grup de recerca vol sintetitzar l'hormona peptídica insulina al bacteri Escherichia coli. Per a això, aïllen directament el gen de la insulina a partir de l'ADN nuclear de cèl·lules pancreàtiques humanes i l'insereixen en un plasmidi bacterià juntament amb un promotor eficaç d'E. coli.

1. a) Després d'introduir el plasmidi als bacteris, comproven que se sintetitza un polipèptid aberrant, inactiu i de mida incorrecta. Explica per què l'ADN genòmic eucariota no es pot expressar adequadament en un bacteri, fent referència a l'estructura del gen i a la maquinària de processament de l'ARN.
2. b) Dissenya l'estratègia biotecnològica per resoldre aquest problema: indica quina molècula has d'aïllar com a motlle inicial, quin tipus d'encebador sintètic específic faries servir aprofitant una modificació posttranscripcional d'aquesta molècula i quin enzim d'origen víric utilitzaràs per sintetitzar el primer filament d'ADN complementari (ADNc).
3. c) En comparar la seqüència de l'ADNc obtingut amb la del gen nuclear inicial, es comprova que l'ADNc és molt més curt i no té la seqüència promotora original humana. Explica per què passa això i justifica com s'aconsegueix que el bacteri transcrigui aquest ADNc un cop clonat en el plasmidi.

CRISPR-Cas9 permet editar el genoma amb gran precisió. Explica de manera senzilla quina funció fa la guia d'ARN i quina funció fa la proteïna Cas9 en aquesta tècnica.