Las técnicas de ingeniería genética

¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para qué se utiliza? Nombra dos situaciones prácticas en las que resulte imprescindible amplificar ADN.

El esquema muestra un ciclo de PCR con sus tres pasos numerados y la temperatura de cada uno. Explica qué ocurre en cada paso y razona por qué cada uno requiere su temperatura característica.

Para amplificar por PCR un fragmento de ADN bicatenario diana, se conoce la secuencia de los extremos de una de sus hebras (leída en sentido 5' $\rightarrow$ 3'):

5'-ATGCCGTAG... [fragmento diana de $600\ \text{pb}$] ...ACGTTCGAT-3'

1. a) Diseña la secuencia y la polaridad (5' $\rightarrow$ 3') de los dos cebadores de ADN (de 9 nucleótidos cada uno) necesarios para amplificar dicha región. Justifica por qué ambos cebadores deben tener secuencias distintas y orientarse en sentidos convergentes.
2. b) Un estudiante programa el termociclador con los siguientes ciclos: $60\ \text{°C}$ (anillamiento) y $72\ \text{°C}$ (elongación), omitiendo intencionalmente el paso a $95\ \text{°C}$. Tras 30 ciclos, analiza la muestra por electroforesis y no observa ninguna banda. Justifica a nivel molecular la causa del fracaso.
3. c) Si se parte de 2 moléculas de ADN bicatenario iniciales y la reacción tiene una eficiencia teórica del $100\ \%$, deduce cuántas moléculas bicatenarias que contengan exclusivamente la longitud exacta delimitada por los cebadores se habrán generado al completarse el tercer ciclo de la PCR. Justifica tu respuesta razonando paso a paso qué ocurre en cada ciclo.

En un laboratorio se pretende amplificar un gen humano mediante PCR, pero por error un técnico utiliza ADN polimerasa I purificada de Escherichia coli en lugar de la polimerasa Taq habitual de Thermus aquaticus.

1. a) Si se aplica el programa térmico estándar ($95\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$ y $72\ \text{°C}$ durante $1\ \text{min}$, repetido 30 veces), predice qué resultado se obtendrá en la electroforesis en gel de agarosa y justifica molecularmente qué le sucede a la enzima de E. coli durante el primer ciclo.
2. b) En los inicios de la técnica, antes del aislamiento de polimerasas termófilas, la PCR se realizaba con ADN polimerasa I de E. coli. Diseña la modificación del protocolo experimental que debían llevar a cabo los investigadores en cada uno de los 30 ciclos para lograr la amplificación y explica qué inconvenientes prácticos planteaba.
3. c) La polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa 3' $\rightarrow$ 5', a diferencia de otras polimerasas termoestables como Pfu. Justifica cuál de las dos enzimas es más idónea para amplificar un gen con fines terapéuticos donde no se toleren errores de secuencia, explicando la función de dicha actividad enzimática.

¿Qué son las enzimas de restricción, de qué organismos se obtienen y cuál es su función en la ingeniería genética?

¿Qué es un organismo transgénico? Pon un ejemplo y explica, en líneas generales, cómo se obtiene.

Ordena los pasos necesarios para clonar un gen humano en bacterias y justifica el orden: introducir el plásmido recombinante en la bacteria, cortar el gen y el plásmido con la misma enzima de restricción, unir el gen al plásmido con ADN ligasa, seleccionar y multiplicar las bacterias transformadas.

Un grupo de investigación quiere sintetizar la hormona peptídica insulina en la bacteria Escherichia coli. Para ello, aíslan directamente el gen de la insulina a partir del ADN nuclear de células pancreáticas humanas y lo insertan en un plásmido bacteriano junto a un promotor eficaz de E. coli.

1. a) Tras introducir el plásmido en las bacterias, comprueban que se sintetiza un polipéptido aberrante, inactivo y de tamaño incorrecto. Explica por qué el ADN genómico eucariota no puede expresarse adecuadamente en una bacteria, haciendo referencia a la estructura del gen y a la maquinaria de procesamiento del ARN.
2. b) Diseña la estrategia biotecnológica para resolver este problema: indica qué molécula debes aislar como molde inicial, qué tipo de cebador sintético específico emplearías aprovechando una modificación postranscripcional de dicha molécula y qué enzima de origen vírico utilizarás para sintetizar la primera hebra de ADN complementario (ADNc).
3. c) Al comparar la secuencia del ADNc obtenido con la del gen nuclear inicial, se comprueba que el ADNc es mucho más corto y carece de la secuencia promotora original humana. Explica por qué ocurre esto y justifica cómo se consigue que la bacteria transcriba dicho ADNc una vez clonado en el plásmido.

CRISPR-Cas9 permite editar el genoma con gran precisión. Explica de forma sencilla qué función desempeña la guía de ARN y qué función desempeña la proteína Cas9 en esta técnica.