Le tecniche di ingegneria genetica

Che cos'è la reazione a catena della polimerasi (PCR) e a che cosa serve? Indica due situazioni pratiche in cui è indispensabile amplificare il DNA.

Lo schema mostra un ciclo di PCR con i suoi tre passaggi numerati e la temperatura di ciascuno. Spiega che cosa avviene in ciascun passaggio e motiva perché ognuno richiede la sua temperatura caratteristica.

Per amplificare tramite PCR un frammento di DNA bicatenario bersaglio, si conosce la sequenza delle estremità di uno dei suoi filamenti (letta in direzione 5' $\rightarrow$ 3'):

5'-ATGCCGTAG... [frammento bersaglio di $600\ \text{pb}$] ...ACGTTCGAT-3'

1. a) Progetta la sequenza e la polarità (5' $\rightarrow$ 3') dei due primer di DNA (di 9 nucleotidi ciascuno) necessari per amplificare tale regione. Giustifica perché i due primer devono avere sequenze diverse e orientarsi in direzioni convergenti.
2. b) Uno studente programma il termociclatore con i seguenti cicli: $60\ \text{°C}$ (appaiamento) e $72\ \text{°C}$ (allungamento), omettendo intenzionalmente il passaggio a $95\ \text{°C}$. Dopo 30 cicli, analizza il campione mediante elettroforesi e non osserva alcuna banda. Giustifica a livello molecolare la causa dell'insuccesso.
3. c) Se si parte da 2 molecole di DNA bicatenario iniziali e la reazione ha un'efficienza teorica del $100\ \%$, deduci quante molecole bicatenarie contenenti esclusivamente la lunghezza esatta delimitata dai primer si saranno generate al termine del terzo ciclo della PCR. Giustifica la risposta ragionando passo per passo su ciò che avviene in ogni ciclo.

In un laboratorio si vuole amplificare un gene umano mediante PCR, ma per errore un tecnico utilizza DNA polimerasi I purificata da Escherichia coli invece della consueta polimerasi Taq di Thermus aquaticus.

1. a) Se si applica il programma termico standard ($95\ \text{°C}$ per $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ per $30\ \text{s}$ e $72\ \text{°C}$ per $1\ \text{min}$, ripetuto 30 volte), prevedi quale risultato si otterrà nell'elettroforesi su gel di agarosio e giustifica a livello molecolare che cosa accade all'enzima di E. coli durante il primo ciclo.
2. b) Agli inizi della tecnica, prima dell'isolamento delle polimerasi termofile, la PCR si eseguiva con la DNA polimerasi I di E. coli. Progetta la modifica del protocollo sperimentale che i ricercatori dovevano effettuare in ciascuno dei 30 cicli per ottenere l'amplificazione e spiega quali inconvenienti pratici comportava.
3. c) La polimerasi Taq è priva di attività esonucleasica 3' $\rightarrow$ 5', a differenza di altre polimerasi termostabili come la Pfu. Giustifica quale dei due enzimi sia più idoneo per amplificare un gene a fini terapeutici in cui non sono tollerati errori di sequenza, spiegando la funzione di tale attività enzimatica.

Che cosa sono gli enzimi di restrizione, da quali organismi si ottengono e qual è la loro funzione nell'ingegneria genetica?

Che cos'è un organismo transgenico? Fai un esempio e spiega, in linee generali, come si ottiene.

Ordina i passaggi necessari per clonare un gene umano in batteri e giustifica l'ordine: introdurre il plasmide ricombinante nel batterio, tagliare il gene e il plasmide con lo stesso enzima di restrizione, unire il gene al plasmide con la DNA ligasi, selezionare e moltiplicare i batteri trasformati.

Un gruppo di ricerca vuole sintetizzare l'ormone peptidico insulina nel batterio Escherichia coli. A tal fine isola direttamente il gene dell'insulina dal DNA nucleare di cellule pancreatiche umane e lo inserisce in un plasmide batterico insieme a un promotore efficace di E. coli.

1. a) Dopo aver introdotto il plasmide nei batteri, verificano che viene sintetizzato un polipeptide aberrante, inattivo e di dimensioni errate. Spiega perché il DNA genomico eucariotico non può essere espresso correttamente in un batterio, facendo riferimento alla struttura del gene e ai meccanismi di maturazione dell'RNA.
2. b) Progetta la strategia biotecnologica per risolvere questo problema: indica quale molecola devi isolare come stampo iniziale, quale tipo di primer sintetico specifico utilizzeresti sfruttando una modificazione post-trascrizionale di tale molecola e quale enzima di origine virale useresti per sintetizzare il primo filamento di DNA complementare (cDNA).
3. c) Confrontando la sequenza del cDNA ottenuto con quella del gene nucleare iniziale, si verifica che il cDNA è molto più corto e privo della sequenza promotrice umana originale. Spiega perché ciò accade e giustifica come si ottiene che il batterio trascriva tale cDNA una volta clonato nel plasmide.

CRISPR-Cas9 permette di modificare il genoma con grande precisione. Spiega in modo semplice quale funzione svolge l'RNA guida e quale funzione svolge la proteina Cas9 in questa tecnica.