A replicação do DNA

O que significa dizer que a replicação do DNA é semiconservativa? Explique com suas próprias palavras, indicando como ficam formadas as duas moléculas de DNA filhas.

Em que momento do ciclo celular o DNA se replica e por que razão é indispensável que a replicação ocorra antes de começar a divisão celular?

Antes da célebre experiência de Meselson e Stahl existiam três modelos teóricos para explicar a replicação do DNA: semiconservativo, conservativo e dispersivo. Imagine que você realiza esta experiência cultivando bactérias E. coli durante muitas gerações em um meio com nitrogênio pesado ($^{15}\text{N}$) até que todo o seu DNA esteja marcado, e depois as transfere para um meio com nitrogênio leve ($^{14}\text{N}$).

1. a) Deduza que tipos de moléculas de DNA (pesadas $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbridas $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ ou leves $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) e em que porcentagens apareceriam no gradiente de densidade após uma e após duas gerações se a replicação fosse:

1. Estritamente conservativa.

2. Estritamente dispersiva.

1. b) Explique de forma fundamentada qual destes dois modelos alternativos ficou descartado logo com a análise do DNA da primeira geração e qual exigiu obrigatoriamente esperar pela segunda geração para ser refutado.

Indique o nome da enzima principal que sintetiza a nova cadeia de DNA durante a replicação, explique qual é a sua função básica e em que sentido (5'→3' ou 3'→5') ela adiciona os nucleotídeos.

Indique o nome da enzima que abre a dupla hélice de DNA na forquilha de replicação e explique que problema mecânico surge na molécula à frente da forquilha (superenrolamento) e que tipo de enzima o resolve.

Os nucleotídeos incorporados na nova cadeia chegam sob a forma de trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Explique de onde a célula obtém a energia necessária para formar as ligações da cadeia em crescimento.

Explique o papel do iniciador (ou primer) de RNA no início da replicação e justifique por que a DNA polimerase não consegue iniciar uma nova cadeia a partir do zero.

Numa forquilha de replicação, uma das novas cadeias (A) é sintetizada de forma contínua avançando em direção à forquilha, enquanto a outra (B) é sintetizada em fragmentos afastando-se dela. Indique qual das novas cadeias (A ou B) é a cadeia contínua (líder) e qual é a cadeia descontínua (atrasada), e explique por que uma é sintetizada de forma contínua e a outra em fragmentos de Okazaki, fazendo referência ao sentido em que a DNA polimerase atua.

Ordene as seguintes etapas da replicação e justifique a ordem escolhida: ligação dos fragmentos pela DNA ligase, abertura da dupla hélice pela helicase, síntese de nucleotídeos pela DNA polimerase, remoção dos iniciadores, formação dos fragmentos de Okazaki.

Indique o nome da enzima que sintetiza os iniciadores de RNA durante a replicação e explique por que cada fragmento de Okazaki precisa do seu próprio iniciador, enquanto a cadeia contínua precisa de apenas um no início.

Após a remoção dos iniciadores de RNA da cadeia descontínua, com que material são preenchidos os espaços vazios e qual enzima sela depois a cadeia? Explique por que a cadeia descontínua demora mais para ser completada do que a cadeia contínua.

Para analisar a síntese das novas cadeias de DNA durante a replicação, realiza-se um ensaio de pulso e perseguição (pulse-chase) em uma cultura bacteriana: as células são expostas à timidina radioativa ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) durante um pulso ultracurto de $5$ segundos e depois são transferidas para um meio com timidina não radioativa em excesso (perseguição) durante $5$ minutos. Após lise e desnaturação alcalina, as cadeias de DNA são separadas por gradiente de densidade em centrífuga. a) Preveja e justifique que padrão de tamanhos de fragmentos radioativos (pequenos, de cerca de $1000$-$2000$ nucleotídeos, ou de elevado peso molecular) será observado no final do pulso ($5$ s) e como mudará após a perseguição ($5$ min). b) Se o mesmo ensaio for realizado em uma linhagem mutante com a DNA ligase bloqueada termicamente, preveja o resultado após os $5$ minutos de perseguição e justifique a sua resposta. c) Justifique por que razão esta experiência refuta a hipótese de que ambas as cadeias sejam sintetizadas de forma contínua.

Para comprovar se a replicação é contínua ou descontínua, uns pesquisadores realizam uma marcação com timidina tritiada durante pulsos de $5$, $15$ e $60$ segundos em bactérias. Após desnaturarem o DNA, analisam o tamanho das cadeias radioativas por centrifugação. Aos $5$ segundos apenas detectam fragmentos curtos ($1000$-$2000$ nucleotídeos), mas à medida que o tempo de marcação aumenta, a radioatividade se desloca progressivamente para fragmentos de grande tamanho molecular. a) Justifique por que este resultado apoia que a replicação ocorre de forma semidescontínua e não contínua em ambas as cadeias. b) Preveja e justifique que resultado teria sido obtido nas três medições se ambas as cadeias fossem sintetizadas de forma contínua a partir da origem de replicação. c) Explique a causa molecular obrigatória (estrutural e enzimática) pela qual a célula se vê forçada a sintetizar uma das duas cadeias à base de pequenos fragmentos.

Durante a replicação, que nucleotídeo será inserido em frente a uma adenina da cadeia molde? E em frente a uma guanina? Explique que propriedade da estrutura do DNA permite que a cópia seja fiel.

A análise química do DNA de uma espécie mostra que $30\ \%$ das suas bases correspondem a adenina. Indique, fundamentando, as porcentagens de timina, guanina e citosina, e explique que consequência tem esta relação de complementaridade para a replicação do DNA.

Quantas forquilhas de replicação se formam a partir de uma única origem de replicação e em que sentido avançam? Explique que vantagem representa o fato de os cromossomos eucarióticos possuírem múltiplas origens de replicação.

Indique duas diferenças entre a replicação de um cromossomo bacteriano e a de um cromossomo humano, levando em conta a forma do DNA e o número de origens de replicação.

A DNA polimerase de E. coli adiciona cerca de $1000$ nucleotídeos por segundo em cada forquilha. Calcule quanto tempo demorará, no mínimo, para replicar o seu cromossomo circular de $4,6$ milhões de pares de bases se ele se replicar a partir de uma única origem de forma bidirecional, e comente o resultado comparando-o com o tempo de geração da bactéria (cerca de $20$ minutos).

Após a replicação, cada cromossomo fica constituído por duas cromátides-irmãs. Explique que relação existe entre as sequências de DNA de ambas as cromátides, por que elas permanecem unidas durante algum tempo e em que momento da divisão celular se separam.

Em embriões precoces do inseto Drosophila melanogaster, a fase S dura apenas $5$ minutos, enquanto nas células somáticas adultas se prolonga por cerca de $8$ horas. No entanto, a velocidade de avanço da forquilha de replicação é idêntica em ambos os estágios: cerca de $40$ nucleotídeos por segundo. a) Se o genoma haploide de Drosophila tem $1,8 \cdot 10^8$ pares de bases, calcule a distância média máxima (em pares de bases) que pode existir entre duas origens de replicação ativas adjacentes no embrião para completar a replicação em $5$ minutos, assumindo replicação bidirecional. b) Interprete a que se deve a diferença na duração da fase S entre o embrião e o adulto se a velocidade de polimerização não se altera. c) Justifique que risco genômico representaria para a célula eucariótica que uma mesma origem de replicação voltasse a ser ativada («disparar») duas vezes dentro de uma mesma fase S e como a célula previne esse acontecimento.