3ª série · Biologia
A biotecnologia · As técnicas da biotecnologia
As técnicas de engenharia genética
A reação em cadeia da polimerase (PCR) O ciclo da PCR: desnaturação, anelamento e extensão Enzimas de restrição: as tesouras moleculares Clonagem molecular e organismos transgênicos Obtenção de DNAc: o gene da insulina CRISPR-Cas9: edição genética de precisão Em resumo
Há quarenta anos, ler ou modificar um gene era trabalho de anos. Hoje, um laboratório da Fiocruz ou do Instituto Butantan consegue copiar um fragmento de DNA um bilhão de vezes numa tarde, cortá-lo e colá-lo em outro organismo. Estas técnicas (PCR, enzimas de restrição, clonagem molecular e CRISPR-Cas9) são a caixa de ferramentas da biotecnologia moderna. Nesta página, o objetivo é interpretar como funcionam e para que servem.
A reação em cadeia da polimerase (PCR)
Na cena de um crime, a perícia recolhe apenas uma gota minúscula de sangue, com uma quantidade de DNA insuficiente para ser analisada. Como obter milhões de cópias idênticas desse fragmento exato em poucas horas, sem recorrer a células vivas?
Técnica que permite obter milhões de cópias de um fragmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima de amostra, sem células vivas: só tubo de ensaio, enzimas e reagentes.
Esquema do crescimento exponencial na PCR: uma molécula de DNA de fita dupla passa a duas cópias após o primeiro ciclo e o processo continua nos ciclos seguintes.
1 molécula
ciclo 1
2 cópias
…
cada ciclo duplica o número de cópias: crescimento exponencial
O DNA molde, dois iniciadores (primers : fragmentos curtos de DNA de fita simples que delimitam a região a copiar), uma DNA polimerase termoestável (polimerase Taq), os quatro nucleotídeos e um termociclador , o aparelho que muda a temperatura do tubo de forma automática e repetida.
Por quê? A DNA polimerase não consegue iniciar uma fita do zero: precisa de uma extremidade $3'\text{-OH}$ já existente, fornecida pelo iniciador, para ligar o nucleotídeo seguinte.
Na eletroforese em gel , o DNA (carregado negativamente) migra do polo negativo para o positivo através do gel. Os fragmentos menores correm mais e chegam mais longe ; os maiores ficam perto dos poços. Cada fragmento forma uma banda , e comparar a posição das bandas com um padrão de tamanhos permite estimar o tamanho dos fragmentos.
Por quê? O gel funciona como uma peneira: fragmentos pequenos atravessam os poros com facilidade, e os grandes são freados. É assim que se compara o DNA de um suspeito com o da cena do crime ou de um suposto pai com o do filho em um teste de paternidade.
Um gel mostra três bandas de uma amostra: uma perto do poço, uma no meio e uma perto do fim do gel.
A banda mais próxima do poço percorreu menos distância: é o fragmento maior .
A banda mais distante do poço é o fragmento menor .
Duas amostras (suspeito e cena do crime) têm bandas nas mesmas posições. O que isso indica? Responda no caderno antes de ver a resposta.
Os fragmentos têm os mesmos tamanhos, então os perfis de DNA coincidem: há compatibilidade entre as amostras.
Passo seguinte (1/5) ★☆☆ Por começar
O que é a reação em cadeia da polimerase (PCR) e para que ela é utilizada? Cite duas situações práticas nas quais seja indispensável amplificar DNA. O que é a reação em cadeia da polimerase (PCR) e para que ela é utilizada? Cite duas situações práticas nas quais seja indispensável amplificar DNA.
Resolver
O ciclo da PCR: desnaturação, anelamento e extensão
Desnaturação ($\approx 94\ \text{°C}$): o calor separa as duas fitas do DNA molde. Anelamento ou pareamento ($\approx 55\ \text{°C}$): os iniciadores se ligam, por complementaridade, a cada fita molde. Extensão ($72\ \text{°C}$): a polimerase Taq acrescenta nucleotídeos a partir do iniciador e copia a fita. O ciclo se repete de 25 a 35 vezes.
A Larissa programa a etapa de desnaturação a $55\ \text{°C}$ e a de anelamento a $94\ \text{°C}$, mas, ao fim de 30 ciclos, não obtém nenhuma cópia de DNA. Por quê?
Ver resposta A $55\ \text{°C}$ as duas fitas do DNA molde não se separam, porque as ligações de hidrogênio se mantêm estáveis; e a $94\ \text{°C}$ os iniciadores não conseguem se ligar. Sem desnaturação não há fitas simples onde a polimerase possa atuar.
Ciclo da PCR em três painéis: a 94 °C as duas fitas do DNA se separam, a 55 °C os iniciadores se ligam a cada fita molde e a 72 °C a polimerase alonga os iniciadores e copia a fita; uma seta volta ao início e se repete 25 a 35 vezes.
1. desnaturação
94 °C
2. anelamento
55 °C
3. extensão
72 °C
DNA molde
iniciador
polimerase
fita nova
repete 25 a 35 vezes
Cada etapa tem a sua temperatura por uma razão. A 94 °C quebram-se as ligações de hidrogênio entre as bases e as fitas se separam. Baixando para cerca de 55 °C, os iniciadores (curtos e abundantes) se emparelham com as sequências complementares das extremidades da região-alvo. A 72 °C é a temperatura ótima da polimerase Taq, que prolonga cada iniciador no sentido $5' \rightarrow 3'$.
Os dois iniciadores têm sequências diferentes porque cada um é complementar de uma fita distinta, e ficam orientados um para o outro: assim, a síntese de cada fita nova avança para a região delimitada pelo outro iniciador.
Os dois iniciadores são diferentes porque se ligam a fitas diferentes, nas extremidades opostas da região-alvo, e ambos são lidos em $5' \rightarrow 3'$.
A $94\ \text{°C}$ uma proteína normal se desnatura e perde a função. A polimerase Taq vem de Thermus aquaticus , uma bactéria de fontes termais, cujas proteínas evoluíram para suportar temperaturas extremas. Por isso aguenta os $94\ \text{°C}$ de cada ciclo e trabalha bem a $72\ \text{°C}$.
Por que não se pode usar uma DNA polimerase humana (ou de E. coli ) em uma PCR?
Ver resposta Ela se desnaturaria já nos $94\ \text{°C}$ do primeiro ciclo e perderia a atividade, o que obrigaria a adicionar enzima nova depois de cada etapa de desnaturação.
Só se amplifica o fragmento compreendido entre os dois iniciadores. O desenho dos iniciadores é, por isso, a decisão mais importante: define exatamente que região do genoma é multiplicada.
★★☆ Por começar
O esquema ilustra um ciclo de PCR com suas três etapas numeradas e a temperatura de cada uma. Explique o que ocorre em cada etapa e justifique por que cada uma requer a… O esquema ilustra um ciclo de PCR com suas três etapas numeradas e a temperatura de cada uma. Explique o que ocorre em cada etapa e justifique por que cada uma requer a sua temperatura característica.
94 °C
55 °C
72 °C
1
2
3
repete-se o ciclo
Resolver
Enzimas de restrição: as tesouras moleculares
Quando um bacteriófago injeta o seu genoma em uma bactéria resistente, o DNA viral é fragmentado de imediato, enquanto o DNA da bactéria fica intacto. Que mecanismo permite reconhecer e cortar sequências invasoras com tanta precisão?
Enzima de origem bacteriana (também chamada de endonuclease de restrição ) que reconhece uma sequência curta e específica de DNA (4 a 8 pares de bases), chamada de sítio de restrição, e corta as duas fitas nesse ponto. Na bactéria que a produz, funciona como defesa contra o DNA de vírus invasores.
A enzima de restrição EcoRI reconhece a sequência-alvo palindrômica GAATTC no DNA de fita dupla e corta as duas fitas de forma escalonada. Ficam dois fragmentos com caudas de fita simples complementares, as extremidades coesivas compatíveis.
EcoRI
enzima de
restrição
C A G A A
T T C T G
G T C T T
A A G A C
5′ 3′
3′ 5′
sequência-alvo (palindrômica)
corte das duas fitas
C A G
G T C
T T A A
A A T T
C T G
G A C
5′ 3′
3′ 5′
3′ 3′
5′ 5′
corte no mesmo ponto da sequência-alvo
caudas de fita simples complementares
Se o gene de interesse e o vetor onde vai ser inserido forem cortados com a mesma enzima de restrição, ficam com extremidades complementares (extremidades coesivas ), o que permite uni-los mesmo que venham de organismos diferentes.
Por quê? Ao cortar a mesma sequência palindrômica (que se lê igual nas duas fitas, no sentido $5' \rightarrow 3'$) na mesma posição relativa, a enzima gera caudas de fita simples iguais, que se encaixam por ligações de hidrogênio.
Uma equipe corta o gene de interesse com EcoRI e o plasmídeo vetor com HindIII, e depois adiciona DNA ligase. Dará resultado?
Ver resposta Não. Cada enzima reconhece uma sequência própria e deixa extremidades coesivas diferentes, que não são complementares. Para a ligase uni-los, os dois fragmentos têm de ter extremidades compatíveis, geradas pela mesma enzima.
★☆☆ Por começar
O que são enzimas de restrição, a partir de que organismos são obtidas e qual é a sua função na engenharia genética? O que são enzimas de restrição, a partir de que organismos são obtidas e qual é a sua função na engenharia genética?
Resolver
Clonagem molecular e organismos transgênicos
Durante décadas, a insulina para tratar o diabetes era extraída de pâncreas de porco, com custo elevado e risco de alergias. Como fazer com que uma bactéria comum produza, sem limite, uma proteína exatamente humana?
Técnica que introduz um fragmento de DNA de interesse em um vetor (geralmente um plasmídeo bacteriano) e o multiplica dentro de bactérias, que crescem e se dividem rapidamente, obtendo muitas cópias idênticas do gene.
Clonagem molecular em quatro passos: corte do plasmídeo e do gene com a mesma enzima de restrição, união com DNA ligase para formar um plasmídeo recombinante, transformação de uma bactéria e seleção das colônias transformadas em um meio com antibiótico.
1. Corte
com a mesma enzima de restrição
plasmídeo
(vetor)
marcador de resistência
DNA doador
gene de interesse
2. União
a DNA ligase sela as pontas
gene
inserido
plasmídeo recombinante
3. Transformação
a bactéria capta o plasmídeo
cromossomo
plasmídeo
bactéria transformada
4. Seleção
meio com antibiótico
só crescem as bactérias
com o plasmídeo
1. Cortar o gene e o plasmídeo com a mesma enzima de restrição. 2. Unir o gene ao plasmídeo com DNA ligase , formando um plasmídeo recombinante. 3. Introduzir esse plasmídeo nas bactérias (transformação). 4. Selecionar e multiplicar as bactérias que o incorporaram, normalmente por meio de um gene marcador de resistência a um antibiótico. Um organismo que incorpora de forma estável DNA de outra espécie é chamado de transgênico (ou OGM, organismo geneticamente modificado). Exemplo: bactérias que produzem insulina humana.
Por que esta ordem? Só se pode ligar depois de cortar com a mesma enzima (extremidades compatíveis); só se pode transformar depois de ter o plasmídeo recombinante; e a seleção vem no fim porque a transformação é pouco eficiente: a maioria das bactérias não capta o plasmídeo, e o antibiótico as elimina para que proliferem apenas as recombinantes.
Em uma clonagem, por que o antibiótico só é adicionado no fim, depois que as bactérias foram postas em contato com o plasmídeo?
Ver resposta Porque a transformação é pouco eficiente: só algumas bactérias captam o plasmídeo recombinante. O antibiótico só tem sentido depois, para eliminar as que não o captaram e deixar proliferar as que têm o gene marcador de resistência.
Obtenção de DNAc: o gene da insulina
O gene humano da insulina tem íntrons, sequências não codificantes que são retiradas do pré-RNAm no processamento (splicing ), um processo que as bactérias não têm.
A solução é partir do RNAm maduro, já sem íntrons, e usar a enzima transcriptase reversa para copiá-lo em DNA complementar (DNAc ). Esse DNAc, contínuo e sem íntrons, é o que se insere no plasmídeo: a bactéria consegue lê-lo e produz a proteína correta.
O que a bactéria obteria se fosse clonado diretamente o gene da insulina retirado do DNA genômico humano?
Ver resposta Ela traduziria os íntrons como se fossem regiões codificantes, por não conseguir eliminá-los, e produziria uma proteína aberrante, truncada e não funcional.
Queremos o gene da insulina em uma forma que a bactéria consiga ler.
Escolhem-se células do pâncreas (as células β), que produzem muito RNAm da insulina, e extrai-se o RNAm maduro.
Com a transcriptase reversa , sintetiza-se uma fita de DNA complementar ao RNAm. Uma DNA polimerase completa a segunda fita e obtém-se DNA de fita dupla, o DNAc.
Que diferença há entre o DNAc e o gene no DNA genômico? Responda no caderno antes de ver a resposta.
O DNAc não tem íntrons, porque foi copiado de um RNAm já processado. O gene genômico tem íntrons e éxons.
Passo seguinte (1/5)
A clonagem molecular isola e multiplica uma sequência de DNA dentro de um vetor. Nada tem a ver com a clonagem de organismos (como a ovelha Dolly), que pretende gerar um indivíduo pluricelular geneticamente idêntico a outro.
★☆☆ Por começar
O que é um organismo transgênico? Dê um exemplo e explique, em linhas gerais, como ele é obtido. O que é um organismo transgênico? Dê um exemplo e explique, em linhas gerais, como ele é obtido.
Resolver
★★☆ Por começar
Ordene as etapas necessárias para clonar um gene humano em bactérias e justifique a sequência: introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, clivar o gene e o… Ordene as etapas necessárias para clonar um gene humano em bactérias e justifique a sequência: introduzir o plasmídeo recombinante na bactéria, clivar o gene e o plasmídeo com a mesma enzima de restrição, ligar o gene ao plasmídeo com a DNA ligase, selecionar e multiplicar as bactérias transformadas.
Resolver
CRISPR-Cas9: edição genética de precisão
O CRISPR-Cas9 é estudado aqui em nível conceitual: serve sobretudo para discutir as potencialidades e as questões éticas da edição genética, tema da página seguinte.
Ferramenta de edição genética derivada de um mecanismo de defesa das bactérias contra vírus. Uma molécula de RNA guia , desenhada em laboratório, leva a proteína Cas9 até uma sequência específica do genoma; aí, a Cas9 corta as duas fitas de DNA, o que permite eliminar, corrigir ou inserir um fragmento nesse ponto exato.
CRISPR-Cas9 em três passos. Primeiro, o RNA guia se liga à proteína Cas9. Depois, o complexo se liga ao DNA e o RNA guia se emparelha com a sequência-alvo complementar. A Cas9 corta aí as duas fitas. O resultado é um corte de fita dupla que os sistemas da célula reparam.
1. RNA guia + Cas9
2. Ligação ao alvo e corte
RNA guia
(chave)
Cas9
(tesoura)
DNA
corte
corte
Cas9
sequência-alvo
3. Resultado: corte de fita dupla
as duas fitas ficam cortadas na sequência-alvo
a célula repara o DNA: elimina, corrige ou insere bases
O RNA guia é desenhado para ser complementar da sequência exata do genoma que se quer editar: é ele que dá a especificidade .
A proteína Cas9 não distingue sequências por si só: corta onde o RNA guia a leva. Mudando apenas o RNA guia, a mesma Cas9 pode se dirigir a qualquer gene, o que explica a rapidez e o baixo custo da técnica.
Se você quiser inativar ao mesmo tempo dois genes diferentes de uma célula, que componentes precisa desenhar?
Ver resposta Dois RNAs guia diferentes (um para cada gene), usando a mesma proteína Cas9 para cortar os dois alvos.
O CRISPR é, na origem, a forma como as bactérias «arquivam» fragmentos do DNA de vírus que as infectaram, para reconhecê-los e destruí-los se voltarem a aparecer. Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier receberam o Prêmio Nobel de Química de 2020 por adaptarem esse sistema natural à edição genética.
A Cas9 atua apenas como tesoura molecular, fazendo um corte de fita dupla na sequência-alvo. A inserção, a deleção ou a correção de bases são feitas pelos sistemas de reparo do DNA da própria célula.
A edição genética pode ajudar a tratar doenças como a anemia falciforme, mas também levanta perguntas éticas, sobretudo quando se pensa em editar embriões, cujas mudanças seriam herdadas. No Brasil, a Lei de Biossegurança (Lei 11.105/2005) e a CTNBio regulam esse tipo de pesquisa.
Por que a edição de células do embrião gera mais debate ético do que a edição de células do sangue de um adulto?
Ver resposta Porque as alterações em embriões podem ser transmitidas às gerações seguintes e a pessoa editada não pode consentir; já a edição de células do sangue de um adulto afeta só ele, que pode decidir.
★★☆ Por começar
O sistema CRISPR-Cas9 permite editar o genoma com alta precisão. Explique de forma simples que função desempenha o RNA guia e que função desempenha a proteína Cas9 nesta… O sistema CRISPR-Cas9 permite editar o genoma com alta precisão. Explique de forma simples que função desempenha o RNA guia e que função desempenha a proteína Cas9 nesta técnica.
Resolver
Voltando ao início: copiar um fragmento um bilhão de vezes é a PCR ; cortar e colar entre organismos se faz com enzimas de restrição e ligase ; e reescrever uma letra do genoma é o que permite o CRISPR-Cas9 .
Em resumo
A PCR amplifica de forma exponencial um fragmento de DNA por meio de ciclos de desnaturação (≈ 94 °C), anelamento dos iniciadores (≈ 55 °C) e extensão com polimerase termoestável, a Taq (72 °C).
A eletroforese em gel separa fragmentos de DNA por tamanho: os menores migram mais.
As enzimas de restrição cortam o DNA em sequências específicas; usar a mesma enzima em dois fragmentos origina extremidades compatíveis, que a DNA ligase une.
A clonagem molecular corta, une, introduz o plasmídeo recombinante em bactérias (transformação) e seleciona as transformadas; obtém-se assim um organismo transgênico .
Para genes humanos com íntrons, parte-se do RNAm maduro e usa-se a transcriptase reversa para obter DNAc .
O CRISPR-Cas9 usa um RNA guia para levar a Cas9 até uma sequência específica do genoma e cortá-la, permitindo editar o DNA com grande precisão.
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