La replicación del ADN

¿Qué significa que la replicación del ADN es semiconservadora? Explíquelo con sus propias palabras, indicando cómo quedan formadas las dos moléculas de ADN hijas.

Antes del célebre experimento de Meselson y Stahl existían tres modelos teóricos para explicar la duplicación del ADN: semiconservativo, conservativo y dispersivo. Imagine que realiza este experimento cultivando bacterias E. coli durante muchas generaciones en un medio con nitrógeno pesado ($^{15}\text{N}$) hasta que todo su ADN esté marcado, y luego las transfiere a un medio con nitrógeno ligero ($^{14}\text{N}$).

1. a) Deduzca qué tipos de moléculas de ADN (pesadas $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, híbridas $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ o ligeras $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) y en qué porcentajes aparecerían en el gradiente de densidad tras una y tras dos generaciones si la replicación fuera:

1. Estrictamente conservativa.

2. Estrictamente dispersiva.

1. b) Razone de forma justificada cuál de estos dos modelos alternativos quedó descartado ya con el análisis del ADN de la primera generación y cuál exigió obligatoriamente esperar a la segunda generación para ser refutado.

Nombre la enzima principal que sintetiza la nueva hebra de ADN durante la replicación y explique cuál es su función básica y en qué sentido (5'→3' o 3'→5') añade los nucleótidos.

¿En qué momento del ciclo celular se replica el ADN y por qué es imprescindible que la replicación ocurra antes de que comience la división celular?

Nombre la enzima que abre la doble hélice de ADN en la horquilla de replicación y explique qué problema mecánico aparece en la molécula por delante de la horquilla (superenrollamiento) y qué tipo de enzima lo resuelve.

Explique el papel del cebador (o primer) de ARN al comienzo de la replicación y razone por qué la ADN polimerasa no puede iniciar una hebra nueva desde cero.

Tras la replicación, cada cromosoma queda formado por dos cromátidas hermanas. Explique qué relación guardan las secuencias de ADN de ambas cromátidas, por qué permanecen unidas durante un tiempo y en qué momento de la división celular se separan.

Los nucleótidos que se incorporan a la nueva hebra llegan como trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Explique de dónde obtiene la célula la energía necesaria para formar los enlaces de la cadena en crecimiento.

En una horquilla de replicación, una de las hebras nuevas (A) se sintetiza de forma continua avanzando hacia la horquilla, mientras que la otra (B) se sintetiza en fragmentos alejándose de ella. Indique cuál de las hebras nuevas (A o B) es la conductora y cuál la rezagada, y explique por qué una se sintetiza de forma continua y la otra en fragmentos de Okazaki, haciendo referencia al sentido en que actúa la ADN polimerasa.

Ordene las siguientes etapas de la replicación y justifique el orden elegido: unión de los fragmentos por la ADN ligasa, apertura de la doble hélice por la helicasa, síntesis de nucleótidos por la ADN polimerasa, eliminación de los cebadores, formación de los fragmentos de Okazaki.

Nombre la enzima que sintetiza los cebadores de ARN durante la replicación y explique por qué cada fragmento de Okazaki necesita su propio cebador mientras que la hebra conductora solo necesita uno al comienzo.

Una vez eliminados los cebadores de ARN de la hebra rezagada, ¿con qué se rellenan los huecos y qué enzima sella después la cadena? Explique por qué la hebra rezagada tarda más en completarse que la conductora.

Para analizar la síntesis de las nuevas hebras de ADN durante la replicación, se realiza un ensayo de pulso y caza en un cultivo bacteriano: las células se exponen a timidina radiactiva ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) durante un pulso ultracorto de $5$ segundos y después se transfieren a un medio con timidina no radiactiva en exceso (caza) durante $5$ minutos. Tras lisis y desnaturalización alcalina, las cadenas de ADN se separan por gradiente de densidad en centrífuga. a) Prediga y justifique qué patrón de tamaños de fragmentos radiactivos (pequeños de unos $1000$-$2000$ nucleótidos o de gran peso molecular) se observará al término del pulso ($5$ s) y cómo cambiará tras la caza ($5$ min). b) Si el mismo ensayo se realiza en una cepa mutante con la ADN ligasa bloqueada térmicamente, prediga el resultado tras los $5$ minutos de caza y justifique su respuesta. c) Razone por qué este experimento refuta la hipótesis de que ambas hebras se sinteticen de manera continua.

Para comprobar si la replicación es continua o discontinua, unos investigadores realizan un marcaje con timidina tritiada durante pulsos de $5$, $15$ y $60$ segundos en bacterias. Tras desnaturalizar el ADN, analizan el tamaño de las cadenas radiactivas por centrifugación. A los $5$ segundos solo detectan fragmentos cortos ($1000$-$2000$ nucleótidos), pero conforme el tiempo de marcaje aumenta, la radiactividad se desplaza progresivamente hacia fragmentos de gran tamaño molecular. a) Razone por qué este resultado apoya que la replicación se produce de forma semidiscontinua y no continua en ambas hebras. b) Prediga y justifique qué resultado se habría obtenido en las tres mediciones si ambas hebras se sintetizaran de forma continua a partir del origen de replicación. c) Explique la causa molecular obligada (estructural y enzimática) por la cual la célula se ve forzada a sintetizar una de las dos hebras a base de pequeños fragmentos.

Durante la replicación, ¿qué nucleótido se insertará frente a una adenina de la hebra molde? ¿Y frente a una guanina? Explique qué propiedad de la estructura del ADN hace posible que la copia sea fiel.

El análisis químico del ADN de una especie muestra que el $30\ \%$ de sus bases es adenina. Indique, razonándolo, los porcentajes de timina, guanina y citosina, y explique qué consecuencia tiene esta relación de complementariedad para la replicación del ADN.

¿Cuántas horquillas de replicación se forman a partir de un único origen de replicación y en qué sentido avanzan? Explique qué ventaja supone que los cromosomas eucariotas tengan muchos orígenes de replicación.

Indique dos diferencias entre la replicación de un cromosoma bacteriano y la de un cromosoma humano, atendiendo a la forma del ADN y al número de orígenes de replicación.

La ADN polimerasa de E. coli añade unos $1000$ nucleótidos por segundo en cada horquilla. Calcule cuánto tiempo tardará, como mínimo, en replicarse su cromosoma circular de $4,6$ millones de pares de bases si se replica desde un único origen de forma bidireccional, y comente el resultado comparándolo con el tiempo de generación de la bacteria (unos $20$ minutos).