Esperimenti classici: Meselson–Stahl e Mendel
Nel 1953 Watson e Crick proposero la doppia elica e subito sorse una domanda: quando il DNA si copia, che fine fanno le due catene originali? Tre modelli erano possibili e nessuno poteva essere scelto «a ragionamento». Servivano un esperimento e dei dati. In questa pagina vediamo come due esperimenti classici, quello di Meselson e Stahl e quelli di Mendel, trasformano un'ipotesi in una conclusione, e come si leggono i numeri che ne escono.
La struttura del DNA
Il DNA è formato da nucleotidi: uno zucchero (desossiribosio), un gruppo fosfato e una base azotata (A, T, G, C). I nucleotidi si legano in una catena con un'estremità 5' e una 3'.
Nella doppia elica le due catene sono antiparallele (una corre in direzione 5'→3', l'altra in 3'→5') e le basi si appaiano per complementarità: A con T (due legami a idrogeno) e G con C (tre). Lo dicono le regole di Chargaff (A = T e G = C), le immagini di diffrazione ai raggi X di Rosalind Franklin e il modello di Watson e Crick.
Poiché ogni catena determina la sequenza dell'altra, ciascuna può fare da stampo per una nuova catena: è l'idea alla base della replicazione.
Il problema: tre modelli di replicazione
Quando una molecola di DNA a doppia elica si duplica, si possono immaginare tre scenari.
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Conservativo: la molecola originale resta intatta e se ne forma una completamente nuova.
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Semiconservativo: ogni molecola figlia ha una catena vecchia e una nuova.
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Dispersivo: le due molecole figlie sono un mosaico di tratti vecchi e nuovi in ciascuna catena.
Questa figura è uno schema: nella seconda riga di ogni modello vedi come sono fatte le molecole dopo la replicazione (la prima riga è il DNA di partenza).
L'esperimento di Meselson e Stahl (1958)
L'idea è «marcare» il DNA vecchio rendendolo più pesante di quello nuovo.
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L'azoto è presente nelle basi azotate. I batteri E. coli vengono cresciuti per molte generazioni in un terreno con $^{15}\text{N}$ (isotopo pesante): tutto il loro DNA diventa pesante.
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Poi vengono trasferiti in un terreno con $^{14}\text{N}$ (isotopo leggero): il DNA sintetizzato da quel momento è leggero.
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Il DNA estratto a ogni generazione viene centrifugato in un gradiente di densità di cloruro di cesio (CsCl), una centrifugazione all'equilibrio: ogni molecola si ferma dove la densità della soluzione è uguale alla sua e forma una banda. DNA pesante, intermedio e leggero formano bande a posizioni diverse.
I risultati:
| Campione | Bande osservate | Interpretazione |
|---|---|---|
| Generazione 0 (solo $^{15}\text{N}$) | una banda pesante | DNA tutto pesante |
| Dopo 1 generazione in $^{14}\text{N}$ | una banda intermedia | ogni molecola ha una catena pesante e una leggera |
| Dopo 2 generazioni | una banda intermedia + una leggera (in parti uguali) | metà delle molecole è ibrida, metà è tutta leggera |
Il risultato della prima generazione esclude il modello conservativo (che avrebbe dato una banda pesante e una leggera, non una sola banda intermedia). Questo risultato, da solo, è compatibile sia con il modello semiconservativo sia con quello dispersivo. La seconda generazione esclude il modello dispersivo: se i tratti vecchi e nuovi si mescolassero a caso, tutto il DNA resterebbe «intermedio» (con densità sempre più vicina a quella leggera), senza una banda leggera distinta. Resta il modello semiconservativo.
Nell'esperimento di Meselson e Stahl (1958) i batteri E. coli* furono cresciuti per più generazioni in un terreno con $^{15}\text{N}$ (isotopo pesante) e poi trasferiti…
Nell'esperimento di Meselson e Stahl (1958) i batteri E. coli furono cresciuti per più generazioni in un terreno con $^{15}\text{N}$ (isotopo pesante) e poi trasferiti in un terreno con $^{14}\text{N}$ (leggero).
- a) Perché usarono due isotopi dell'azoto?
- b) Con quale tecnica separarono il DNA a diversa densità?
Nell'esperimento di Meselson e Stahl, dopo una generazione nel terreno con $^{14}\text{N}$ tutto il DNA si trova in una sola banda a densità intermedia. a) Quale…
Nell'esperimento di Meselson e Stahl, dopo una generazione nel terreno con $^{14}\text{N}$ tutto il DNA si trova in una sola banda a densità intermedia.
- a) Quale composizione ha il DNA di questa banda?
- b) Quale modello di replicazione è escluso da questo risultato? Spiega.
Nell'esperimento di Meselson–Stahl, a partire da DNA completamente pesante ($^{15}\text{N}/^{15}\text{N}$), si lasciano replicare i batteri in terreno con…
Nell'esperimento di Meselson–Stahl, a partire da DNA completamente pesante ($^{15}\text{N}/^{15}\text{N}$), si lasciano replicare i batteri in terreno con $^{14}\text{N}$.
- a) Calcola la proporzione di DNA intermedio e leggero dopo $2$ generazioni.
- b) Calcola le proporzioni dopo $3$ generazioni.
- c) Spiega perché la proporzione di DNA pesante dopo la prima generazione è $0$.
Leggere i dati come uno scienziato
Un esperimento convince se prevede risultati diversi per le ipotesi in competizione. Meselson e Stahl l'hanno fatto: ogni modello prevede bande diverse a ogni generazione.
Un'analisi più fine: se il DNA intermedio viene denaturato (riscaldato, le due catene si separano), si osservano le singole catene.
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Semiconservativo: due bande, una di catene pesanti e una di catene leggere (ognuna una catena intera).
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Dispersivo: una sola banda di densità intermedia, perché ogni catena è un mosaico.
Un risultato è affidabile solo con controlli: DNA pesante e DNA leggero puri, centrifugati da soli, servono a sapere dove cadono le bande di riferimento. Inoltre l'esperimento riguarda E. coli: per altri organismi serve una verifica separata (ad esempio marcando il DNA di cellule eucariotiche con un analogo della timidina per più cicli).
In una variante dell'esperimento di Meselson–Stahl, dopo $1$ generazione in $^{14}\text{N}$ il DNA intermedio viene riscaldato (denaturato) e le singole catene vengono…
In una variante dell'esperimento di Meselson–Stahl, dopo $1$ generazione in $^{14}\text{N}$ il DNA intermedio viene riscaldato (denaturato) e le singole catene vengono analizzate nel gradiente.
- a) Quali bande si osservano se la replicazione è semiconservativa?
- b) Quali bande si osserverebbero se la replicazione fosse dispersiva?
- c) Quale risultato permette di escludere il modello dispersivo dopo la seconda generazione? Giustifica.
Uno studente sostiene: «L'esperimento di Meselson–Stahl dimostra che il DNA si replica in modo semiconservativo in tutti gli organismi». a) Valuta criticamente…
Uno studente sostiene: «L'esperimento di Meselson–Stahl dimostra che il DNA si replica in modo semiconservativo in tutti gli organismi».
- a) Valuta criticamente l'affermazione, indicando i limiti dell'esperimento.
- b) Quali controlli sperimentali erano necessari per validare l'interpretazione delle bande?
- c) Proponi come verificare la stessa ipotesi in una cellula eucariotica, descrivendo i dati attesi.
Mendel: dai numeri alle leggi
Gregor Mendel incrociò per anni piante di pisello (Pisum sativum), scelse caratteri con due varianti nette (liscio/rugoso, giallo/verde, viola/bianco) e contò i discendenti. Dai rapporti numerici dedusse l'esistenza di fattori ereditari (oggi: geni e alleli).
Partì da linee pure: ad esempio seme liscio $LL$ e seme rugoso $ll$.
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$P$: $LL \times ll$
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$F_1$: tutte $Ll$, tutte a seme liscio (dominanza, uniformità degli ibridi).
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$F_2$ ($Ll \times Ll$): rapporto fenotipico 3 : 1 (liscio : rugoso) e genotipico $1\,LL : 2\,Ll : 1\,ll$.
Il rapporto $3:1$ è un valore atteso: vale per grandi numeri, come per il lancio di una moneta. Nei dati reali si osservano piccole deviazioni.
Mendel incrociò piante di pisello a seme liscio puro (LL*) con piante a seme rugoso (ll*). a) Indica genotipo e fenotipo della generazione $F_1$. b) Quale rapporto…
Mendel incrociò piante di pisello a seme liscio puro (LL) con piante a seme rugoso (ll).
- a) Indica genotipo e fenotipo della generazione $F_1$.
- b) Quale rapporto fenotipico si attende in $F_2$?
In un esperimento di Mendel, da un incrocio tra piante eterozigoti per il colore del seme ($Gg \times Gg$, giallo dominante) si ottengono $8.023$ semi: $6.022$ gialli e…
In un esperimento di Mendel, da un incrocio tra piante eterozigoti per il colore del seme ($Gg \times Gg$, giallo dominante) si ottengono $8.023$ semi: $6.022$ gialli e $2.001$ verdi.
- a) Calcola il rapporto approssimato giallo : verde.
- b) Confronta con il rapporto atteso $3:1$ e calcola i numeri attesi.
- c) Perché è importante analizzare un numero elevato di individui?
L'incrocio di verifica (testcross)
Un fiore viola può essere $PP$ o $Pp$: il fenotipo non basta. Come si scopre il genotipo? Si incrocia con un individuo omozigote recessivo ($pp$), che porta solo l'allele recessivo, quindi il fenotipo della prole mostra direttamente i gameti dell'altro genitore.
| Genitore ignoto | Prole attesa |
|---|---|
| $PP$ | $100\%$ viola |
| $Pp$ | $50\%$ viola, $50\%$ bianchi |
Se tra i discendenti compare anche un solo fiore bianco, il genitore ignoto era eterozigote. Se tutti sono viola (in un numero elevato di figli), è molto probabilmente $PP$.
Un incrocio test (testcross*) tra una pianta di pisello a fiore viola di genotipo sconosciuto e una a fiore bianco ($pp$) produce $52$ piante a fiore viola e $48$ a…
Un incrocio test (testcross) tra una pianta di pisello a fiore viola di genotipo sconosciuto e una a fiore bianco ($pp$) produce $52$ piante a fiore viola e $48$ a fiore bianco.
- a) Deduci il genotipo della pianta sconosciuta.
- b) Quale risultato avresti ottenuto se fosse stata omozigote dominante?
- c) Spiega perché l'incrocio test è un buon metodo per determinare un genotipo.
Il test del χ² e la ricombinazione
Con due geni ($RrYy \times rryy$) Mendel si attende, per assortimento indipendente, quattro classi uguali ($1:1:1:1$), ciascuna al $25\%$. Come si decide se i dati si discostano troppo?
Un genetista incrocia piante di pisello doppie eterozigoti $RrYy$ (rotondo/giallo dominanti) con piante $rryy$ e ottiene: $310$ rotondi-gialli, $287$ rugosi-verdi, $95$…
Un genetista incrocia piante di pisello doppie eterozigoti $RrYy$ (rotondo/giallo dominanti) con piante $rryy$ e ottiene: $310$ rotondi-gialli, $287$ rugosi-verdi, $95$ rotondi-verdi, $108$ rugosi-gialli. (Totale: $800$.)
- a) Calcola le frequenze attese se i geni fossero indipendenti.
- b) Calcola il valore $\chi^2 = \sum \frac{(O-E)^2}{E}$ e confrontalo con il valore critico $7,81$ (3 gradi di libertà, $p = 0,05$).
- c) Che cosa suggeriscono i dati sulla posizione dei due geni? Calcola la frequenza di ricombinazione.
Vuoi riprendere il filo? Nel 1953 si chiedeva che cosa succede alle catene vecchie: l'esperimento del 1958 mostra che ogni molecola figlia ne conserva una; e come per Mendel, le conclusioni vengono dai numeri letti con metodo.
In sintesi
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Tre modelli di replicazione (conservativo, semiconservativo, dispersivo) fanno previsioni diverse: un buon esperimento le distingue.
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Meselson e Stahl usarono $^{15}\text{N}$ e $^{14}\text{N}$ e la centrifugazione in gradiente di CsCl: la banda intermedia alla 1ª generazione esclude il conservativo; la 2ª generazione esclude il dispersivo.
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Nel modello semiconservativo, alla generazione $n$ il DNA intermedio è $2/2^n$ e il leggero $(2^n-2)/2^n$.
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Mendel ricava le sue leggi da rapporti numerici su campioni grandi: $3:1$ in $F_2$; il testcross con $pp$ rivela il genotipo.
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Alla base c'è la struttura del DNA: doppia elica con basi complementari (regole di Chargaff, immagini di Franklin, modello di Watson e Crick). Nella forca di replicazione l'elicasi apre le catene e la DNA polimerasi sintetizza quelle nuove: così ogni molecola figlia conserva una catena originale.
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Il test del $\chi^2$ confronta dati osservati e attesi; se supera il valore critico, l'ipotesi (ad es. indipendenza) si rifiuta e si può stimare la frequenza di ricombinazione.