L'espressione genica

Quale enzima catalizza la trascrizione del DNA in RNA? Indica su quale dei due filamenti del gene agisce e in quale senso sintetizza la molecola di RNA.

Indica due differenze strutturali tra DNA e RNA, e spiega quali basi si appaiano durante la trascrizione quando il filamento stampo presenta un'adenina o una timina.

A partire dal filamento stampo di DNA 3'-TACGGAACT-5', ricava la sequenza dell'RNA messaggero risultante indicandone la polarità, e indica quanti amminoacidi al massimo può codificare quel frammento.

Che cos'è un codone? Indica da quanti nucleotidi è formato, quanti codoni diversi esistono e quanti amminoacidi diversi codificano complessivamente.

Osserva lo schema del flusso dell'informazione genetica. Indica quali molecole sono segnalate con A, B e C, quali processi avvengono nelle frecce 1 e 2, e che cosa rappresenta la zona circondata dalla linea tratteggiata.

Considera il seguente frammento della sequenza codificante di un RNAm che viene tradotto in una proteina citoplasmatica:

$5'\text{--- AUG - UCU - UCC - UCA - UCG --- } 3'$

(Nota: i quattro codoni che seguono il codone di inizio AUG codificano tutti l'amminoacido serina).

1. a) A partire da questo caso concreto, giustifica perché il codice genetico è degenerato e dimostra che questa proprietà non equivale a dire che il codice sia «ambiguo».
2. b) Supponi di introdurre due mutazioni puntiformi indipendenti: il Mutante 1 cambia il secondo codone da UCU a UCC; il Mutante 2 cambia il terzo codone da UCC a UAC (che codifica tirosina). Confronta l'impatto di entrambe le mutazioni sulla sequenza di amminoacidi della proteina e classifica ciascuna mutazione in base al suo effetto funzionale.
3. c) Ragiona su quale vantaggio adattativo conferisce il fatto che la degenerazione del codice genetico si concentri quasi sempre sulla terza base di ogni tripletta (ipotesi del vacillamento) anziché sulla prima o sulla seconda, rispetto alle mutazioni puntiformi spontanee.

Per tradurre i $61$ codoni con senso nel codice genetico standard, la maggior parte delle cellule eucariotiche ha bisogno di sintetizzare solo tra $30$ e $45$ specie diverse di tRNA, anziché $61$.

1. a) Spiega la base termodinamica e strutturale dell'«ipotesi del vacillamento» (wobble) di Crick e giustifica perché questa flessibilità spaziale è limitata al terzo nucleotide del codone (estremità $3'$) e al primo dell'anticodone (estremità $5'$).
2. b) L'amminoacido valina è codificato da quattro codoni: $5'\text{-GUU-}3'$, $5'\text{-GUC-}3'$, $5'\text{-GUA-}3'$ e $5'\text{-GUG-}3'$. Se un tRNA specifico presenta inosina (I) all'estremità $5'$ del suo anticodone (sapendo che l'inosina può appaiarsi con U, C e A), determina quanti e quali di questi codoni potrà leggere questo unico tRNA, scrivendo la sequenza di tale anticodone in direzione $5'\to 3'$.
3. c) Spiega il vantaggio adattativo che comporta per l'organismo il fatto che la degenerazione del codice genetico e il vacillamento si concentrino nella terza posizione del codone, rispetto al caso in cui avvenissero sulla prima o sulla seconda base, di fronte a mutazioni puntiformi.

Nella terapia genica per la sindrome da neuropatia ottica ereditaria di Leber si studia il trasferimento di una copia selvatica di un gene mitocondriale al nucleo cellulare (espressione allotopica) affinché la proteina venga tradotta nel citosol e importata nel mitocondrio. Tuttavia, nel codice genetico mitocondriale umano la tripletta UGA codifica il triptofano, mentre nel codice nucleare standard agisce da codone di terminazione.

1. a) Prevedi che cosa accadrebbe se il gene mitocondriale venisse trasferito al nucleo senza modificarne la sequenza e fosse trascritto e tradotto nei ribosomi citoplasmatici. Quale ripercussione avrebbe sulla lunghezza e sulla funzionalità del polipeptide ottenuto?
2. b) Progetta la strategia di mutagenesi sito-diretta che il gruppo biotecnologico deve applicare alla sequenza codificante del transgene prima di integrarlo nel nucleo per garantire la sintesi della proteina nativa.
3. c) Giustifica perché il genoma mitocondriale (con soli $37$ geni e un numero molto ridotto di tRNA) ha potuto «permettersi» derive e cambiamenti nell'assegnazione dei codoni nel corso dell'evoluzione, mentre nel genoma nucleare questo tipo di alterazioni risulta letale per la cellula.

Qual è il codone di inizio della traduzione e quale amminoacido codifica? Spiega quale funzione svolgono i codoni di terminazione e che cosa accade quando il ribosoma ne raggiunge uno.

Descrivi brevemente che cosa fa il ribosoma durante la traduzione: come legge l'RNAm, come arrivano gli amminoacidi e quale tipo di legame si forma tra di essi.

A partire dalla seguente tabella del codice genetico:

1. a) Traduci il seguente $\text{ARNm}$: $5'\text{-AUGGCUUAA-}3'$, e indica la sequenza di amminoacidi risultante.
2. b) Spiega quale ruolo svolgono il primo e l'ultimo codone del frammento.

Durante la traduzione, l'RNAm viene letto in codoni consecutivi, senza separatori tra di essi. Spiega che cos'è il modulo (o fase) di lettura e ragiona su che cosa accadrebbe alla proteina sintetizzata se il ribosoma iniziasse la lettura un nucleotide prima della posizione corretta.

Si studia un gene umano di $24\,000$ paia di basi (pb) costituito da $8$ esoni e $7$ introni. Dopo essere stato processato completamente, il suo mRNA maturo nelle cellule muscolari ha una lunghezza di $1200$ nucleotidi (comprese le regioni UTR e la coda di poli-A).

1. a) Se in laboratorio si ibrida il filamento stampo del DNA genomico con tale mRNA maturo muscolare e si osserva l'eteroduplex risultante al microscopio elettronico, prevedi quale morfologia presenterà e quanti anelli a singolo filamento si osserveranno al massimo. Giustifica da quale acido nucleico sarà formato ciascun anello.
2. b) Uno studente afferma che, avendo $1200$ nucleotidi, la proteina risultante avrà esattamente $400$ amminoacidi di lunghezza. Confuta con argomenti questa affermazione, fornendo almeno due argomenti di natura molecolare.
3. c) Nel tessuto nervoso si isola un mRNA maturo proveniente dallo stesso gene ma con una dimensione di $1500$ nucleotidi. Spiega quale fenomeno si è verificato e prevedi se la proteina neuronale sarà necessariamente più lunga di quella muscolare, giustificando la risposta.

Definisci che cos'è un gene dal punto di vista dell'espressione genica e indica quali due tipi di prodotti funzionali può generare un gene quando si esprime.

Una proteina è formata da $300$ amminoacidi. a) Calcola quanti nucleotidi ha, come minimo, l'RNAm maturo che la codifica, includendo il codone di terminazione. b) Calcola quante paia di basi occuperebbe il gene in un organismo privo di introni. c) Ragiona sul perché negli organismi eucarioti il gene è di solito molto più lungo del corrispondente RNAm maturo.

Nel genoma umano, il gene della fibronectina contiene numerosi esoni e introni. Nei fibroblasti dà origine a un'isoforma proteica insolubile che fa parte della matrice extracellulare, mentre negli epatociti origina un'isoforma solubile che circola nel plasma sanguigno.

1. a) Giustifica quale meccanismo molecolare permette a un'unica sequenza di DNA genomico di dare origine a queste due proteine con funzioni e localizzazioni così diverse.
2. b) Un paziente presenta una mutazione puntiforme consistente in una transizione (G al posto di A) nel sito accettore di splicing dell'introne 4 di questo gene. Prevedi due possibili alterazioni nella struttura dell'mRNA maturo risultante e le loro conseguenze sulla proteina sintetizzata.
3. c) Se cloniamo questo gene umano intatto (con tutti i suoi introni ed esoni) in un plasmide e lo introduciamo in Escherichia coli, spiega se il batterio sintetizzerà la fibronectina umana funzionale.

Definisci trascrizione e traduzione e indica in quale luogo della cellula eucariote avviene ciascuno di questi processi.

Ordina le seguenti fasi dell'espressione genica in una cellula eucariote e giustifica l'ordine scelto: legame dell'RNAm al ribosoma, maturazione dell'RNAm, traduzione nel citosol, uscita dell'RNAm dal nucleo, trascrizione nel nucleo.

La streptomicina è un antibiotico battericida che si lega alla subunità $30\text{S}$ del ribosoma procariote ($70\text{S}$), provocando letture errate dell'mRNA e inibendo la sintesi proteica. Sebbene sia considerata selettiva nei confronti dei ribosomi citoplasmatici eucariotici ($80\text{S}$), i pazienti sottoposti a trattamenti intensivi manifestano spesso nefrotossicità e ototossicità associate a disfunzione energetica cellulare.

1. a) Basandoti sulla teoria endosimbiontica, giustifica perché questo farmaco può danneggiare le cellule umane e provocare un deficit di ATP nonostante la selettività del bersaglio descritta.
2. b) Analizzando un ceppo batterico resistente alla streptomicina, si verifica che non degrada il farmaco né possiede pompe di efflusso attivo, ma presenta una mutazione nel gene del cromosoma batterico che codifica l'rRNA $16\text{S}$. Spiega come questa mutazione conferisca resistenza senza impedire del tutto la funzione del ribosoma.
3. c) In un esperimento cellulare si impiegano cicloeximide (inibitore dei ribosomi $80\text{S}$) e cloramfenicolo (inibitore dei ribosomi $70\text{S}$). Prevedi che cosa accadrà all'assemblaggio dei complessi multienzimatici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (le cui subunità hanno un'origine genetica duplice) in presenza di ciascuno di questi composti separatamente.

Osservando al microscopio elettronico l'espressione genica nei batteri (Escherichia coli), si distinguono strutture ad «albero di Natale» in cui più ribosomi traducono l'mRNA mentre questo è ancora in corso di sintesi da parte della RNA polimerasi legata al DNA genomico. In una cellula umana, invece, ciò non si osserva mai.

1. a) Prevedi quale conseguenza immediata avrà sulla sintesi delle proteine batteriche l'aggiunta di rifampicina (un inibitore che blocca l'inizio dell'attività della RNA polimerasi ma non l'attività dei ribosomi) e confronta questo effetto con ciò che accadrebbe a breve termine nel citoplasma di una cellula eucariote.
2. b) Spiega perché l'accoppiamento trascrizione-traduzione batterico è meccanicamente incompatibile con la presenza di introni e con il meccanismo di splicing tipico degli eucarioti.
3. c) Il meccanismo di regolazione genica per «attenuazione» nell'operone del triptofano batterico dipende dal fatto che la velocità di avanzamento del ribosoma in una sequenza leader determina la formazione di forcine di terminazione nell'RNA appena trascritto. Giustifica con argomenti perché questo sistema di regolazione non è praticabile nelle cellule eucariotiche.

Distingui la funzione dell'RNAm, dell'RNAt e dell'RNAr nella sintesi proteica, indicando che cosa apporta ciascun tipo di RNA al processo.

Descrivi la struttura caratteristica di un RNAt (forma a trifoglio, anticodone ed estremità 3') e spiega come la cellula fa in modo che ogni RNAt venga caricato con il proprio amminoacido corretto, menzionando gli enzimi responsabili.

Il seguente schema rappresenta un ribosoma funzionale durante la fase di allungamento della traduzione:

1. a) Deduci in modo motivato la polarità (estremità $5'$ e $3'$) della catena di RNAm e il senso in cui il ribosoma si sposterà lungo di essa.
2. b) Scrivi la sequenza dell'anticodone dell'RNAt indicato con il punto interrogativo (?) specificandone obbligatoriamente la polarità $5'\to 3'$ e ragiona su quale amminoacido trasporta sapendo che il codone GCU codifica alanina.
3. c) In un ceppo mutante si produce un RNAt soppressore in grado di riconoscere il codone UAA introducendo l'amminoacido tirosina. Prevedi che cosa accadrà alla traduzione e alla lunghezza della proteina risultante quando il ribosoma raggiungerà la posizione indicata con il codone di stop, rispetto alla cellula selvatica.