La replicazione del DNA

Durante la replicazione, quale nucleotide verrà inserito di fronte a un'adenina del filamento stampo? E di fronte a una guanina? Spiega quale proprietà della struttura del DNA rende possibile che la copia sia fedele.

L'analisi chimica del DNA di una specie mostra che il $30\ \%$ delle sue basi è adenina. Indica, motivandolo, le percentuali di timina, guanina e citosina, e spiega quale conseguenza ha questa relazione di complementarità per la replicazione del DNA.

Che cosa significa che la replicazione del DNA è semiconservativa? Spiegalo con parole tue, indicando come risultano formate le due molecole di DNA figlie.

In quale momento del ciclo cellulare viene replicato il DNA e perché è indispensabile che la replicazione avvenga prima dell'inizio della divisione cellulare?

Prima del celebre esperimento di Meselson e Stahl esistevano tre modelli teorici per spiegare la duplicazione del DNA: semiconservativo, conservativo e dispersivo. Immagina di realizzare questo esperimento coltivando batteri E. coli per molte generazioni in un terreno con azoto pesante ($^{15}\text{N}$) finché tutto il loro DNA non sia marcato, e poi di trasferirli in un terreno con azoto leggero ($^{14}\text{N}$).

1. a) Deduci quali tipi di molecole di DNA (pesanti $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, ibride $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ o leggere $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) e in quali percentuali comparirebbero nel gradiente di densità dopo una e dopo due generazioni se la replicazione fosse:

1. Strettamente conservativa.

2. Strettamente dispersiva.

1. b) Ragiona in modo motivato su quale di questi due modelli alternativi fu già scartato con l'analisi del DNA della prima generazione e quale ha richiesto necessariamente di attendere la seconda generazione per essere confutato.

Indica l'enzima principale che sintetizza il nuovo filamento di DNA durante la replicazione e spiega qual è la sua funzione di base e in quale senso (5'→3' o 3'→5') aggiunge i nucleotidi.

Indica l'enzima che apre la doppia elica del DNA nella forcella di replicazione e spiega quale problema meccanico compare nella molecola davanti alla forcella (superavvolgimento) e quale tipo di enzima lo risolve.

I nucleotidi che si incorporano nel nuovo filamento arrivano come trifosfati (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Spiega da dove la cellula ottiene l'energia necessaria per formare i legami della catena in crescita.

Spiega il ruolo dell'innesco (o primer) di RNA all'inizio della replicazione e ragiona sul perché la DNA polimerasi non può iniziare un nuovo filamento da zero.

In una forcella di replicazione, uno dei nuovi filamenti (A) viene sintetizzato in modo continuo avanzando verso la forcella, mentre l'altro (B) viene sintetizzato in frammenti allontanandosi da essa. Indica quale dei nuovi filamenti (A o B) è il filamento veloce (guida) e quale quello lento (ritardato), e spiega perché uno viene sintetizzato in modo continuo e l'altro in frammenti di Okazaki, facendo riferimento al senso in cui agisce la DNA polimerasi.

Ordina le seguenti fasi della replicazione e giustifica l'ordine scelto: unione dei frammenti da parte della DNA ligasi, apertura della doppia elica da parte dell'elicasi, sintesi dei nucleotidi da parte della DNA polimerasi, eliminazione degli inneschi, formazione dei frammenti di Okazaki.

Indica l'enzima che sintetizza gli inneschi di RNA durante la replicazione e spiega perché ogni frammento di Okazaki necessita del proprio innesco mentre il filamento veloce ne richiede uno solo all'inizio.

Una volta eliminati gli inneschi di RNA dal filamento lento, con che cosa vengono riempiti i vuoti e quale enzima sigilla poi la catena? Spiega perché il filamento lento impiega più tempo a completarsi rispetto a quello veloce.

Per analizzare la sintesi dei nuovi filamenti di DNA durante la replicazione, si esegue un saggio di pulse-chase in una coltura batterica: le cellule vengono esposte a timidina radioattiva ($[^3\text{H}]\text{-timidina}$) per un impulso ultracorto di $5$ secondi e poi trasferite in un terreno con timidina non radioattiva in eccesso (chase) per $5$ minuti. Dopo lisi e denaturazione alcalina, le catene di DNA vengono separate mediante gradiente di densità in centrifuga. a) Prevedi e giustifica quale schema di dimensioni dei frammenti radioattivi (piccoli, di circa $1000$-$2000$ nucleotidi, o ad alto peso molecolare) si osserverà al termine dell'impulso ($5$ s) e come cambierà dopo il chase ($5$ min). b) Se lo stesso saggio viene eseguito in un ceppo mutante con la DNA ligasi bloccata termicamente, prevedi il risultato dopo i $5$ minuti di chase e giustifica la risposta. c) Ragiona sul perché questo esperimento confuta l'ipotesi che entrambi i filamenti siano sintetizzati in modo continuo.

Per verificare se la replicazione è continua o discontinua, alcuni ricercatori eseguono una marcatura con timidina triziata durante impulsi di $5$, $15$ e $60$ secondi in batteri. Dopo la denaturazione del DNA, analizzano la dimensione delle catene radioattive mediante centrifugazione. A $5$ secondi rilevano solo frammenti corti ($1000$-$2000$ nucleotidi), ma man mano che il tempo di marcatura aumenta, la radioattività si sposta progressivamente verso frammenti di grandi dimensioni molecolari. a) Ragiona sul perché questo risultato sostiene che la replicazione avvenga in modo semidiscontinuo e non continuo su entrambi i filamenti. b) Prevedi e giustifica quale risultato si sarebbe ottenuto nelle tre misurazioni se entrambi i filamenti fossero sintetizzati in modo continuo a partire dall'origine di replicazione. c) Spiega la causa molecolare obbligata (strutturale ed enzimatica) per la quale la cellula è costretta a sintetizzare uno dei due filamenti a partire da piccoli frammenti.

In un laboratorio si ottiene un ceppo mutante di Escherichia coli che presenta un'alterazione nella DNA polimerasi III: mantiene intatta la sua velocità di polimerizzazione in direzione $5'\to 3'$, ma ha perso completamente la sua attività esonucleasica $3'\to 5'$. a) Prevedi e giustifica quale effetto avrà questa mutazione sulla fedeltà di copia e sul tasso di mutazioni spontanee per divisione cellulare. b) Se questo ceppo viene coltivato in presenza di 2-aminopurina (un analogo di base che può appaiarsi in modo errato con la citosina), ragiona se il tasso di fissazione delle mutazioni sarà maggiore, minore o uguale rispetto al ceppo selvatico. c) Giustifica a livello molecolare perché l'attività di correzione di bozze deve rimuovere il nucleotide errato in direzione $3'\to 5'$ prima di proseguire con l'aggiunta del nucleotide successivo.

Si isola un mutante termosensibile di lievito per il gene che codifica la DNA ligasi I. A $25\text{ }^\circ\text{C}$ il lievito si divide normalmente, ma coltivandolo a $37\text{ }^\circ\text{C}$ l'enzima si inattiva e la cellula arresta il proprio ciclo cellulare prima di entrare in mitosi. a) Uno studente afferma: «A $37\text{ }^\circ\text{C}$, solo il filamento lento presenterà interruzioni perché in esso si formano i frammenti di Okazaki; il filamento veloce sarà un'unica catena perfettamente continua da un'estremità all'altra del cromosoma». Confuta questa affermazione tenendo conto della presenza di molteplici origini di replicazione (repliconi) per cromosoma lineare. b) Specifica il tipo esatto di legame chimico che non può essere sigillato in assenza di ligasi (indicando i gruppi chimici terminali $3'$ e $5'$) e ragiona sul perché le DNA polimerasi non possono eseguire da sole questa reazione di sigillatura. c) Giustifica perché la presenza di interruzioni non sigillate nella doppia elica attiva un punto di controllo del ciclo cellulare impedendo la mitosi.

La replicazione del DNA raggiunge una fedeltà straordinaria grazie a tre barriere successive: la specificità di appaiamento della DNA polimerasi (errore di $1$ ogni $10^5$ nucleotidi), la correzione di bozze esonucleasica $3'\to 5'$ (errore finale di $1$ ogni $10^7$) e il sistema postreplicativo di riparazione dei appaiamenti errati (mismatch repair, errore finale di $1$ ogni $10^9$). a) Una linea cellulare di cancro colorettale ereditario (sindrome di Lynch) presenta un tasso di mutazione $100$ volte superiore al normale, nonostante le sue DNA polimerasi abbiano attività polimerasica ed esonucleasica intatte. Deduci e giustifica quale meccanismo sta fallendo in queste cellule. b) Per correggere un errore dopo il passaggio della forcella, il sistema di riparazione deve distinguere il filamento stampo (vecchio) da quello appena sintetizzato. Ragiona su come il macchinario cellulare riesce a discriminare i due filamenti per evitare di sostituire la base del filamento originale. c) Se un errore di appaiamento (per esempio, una guanina appaiata erroneamente a una timina) sfugge a tutti i sistemi di correzione e la cellula attraversa due cicli completi di divisione cellulare, deduci quale proporzione delle molecole di DNA figlie finali porterà la mutazione ormai fissata in modo permanente.

Quante forcelle di replicazione si formano a partire da una singola origine di replicazione e in quale senso avanzano? Spiega quale vantaggio comporta il fatto che i cromosomi eucarioti abbiano molte origini di replicazione.

Indica due differenze tra la replicazione di un cromosoma batterico e quella di un cromosoma umano, in base alla forma del DNA e al numero di origini di replicazione.

La DNA polimerasi di E. coli aggiunge circa $1000$ nucleotidi al secondo in ciascuna forcella. Calcola quanto tempo impiegherà, come minimo, a replicarsi il suo cromosoma circolare di $4,6$ milioni di paia di basi se si replica da un'unica origine in modo bidirezionale, e commenta il risultato confrontandolo con il tempo di generazione del batterio (circa $20$ minuti).

Dopo la replicazione, ogni cromosoma risulta formato da due cromatidi fratelli. Spiega quale relazione hanno le sequenze di DNA dei due cromatidi, perché restano uniti per un certo tempo e in quale momento della divisione cellulare si separano.

In laboratorio si confrontano due colture cellulari umane: fibroblasti dermici normali e cellule tumorali di una linea di carcinoma polmonare. Nel corso di $60$ raddoppiamenti della popolazione si monitora la lunghezza media dei telomeri. I fibroblasti entrano in senescenza replicativa al raddoppiamento $40$ con un progressivo accorciamento telomerico, mentre le cellule tumorali proliferano in modo continuo e mantengono intatta la lunghezza dei loro telomeri. a) Giustifica a livello molecolare perché il macchinario di replicazione convenzionale non può completare l'estremità $5'$ del filamento lento dopo l'eliminazione dell'ultimo innesco di RNA (il «problema dell'estremità»). b) Si progetta una terapia che introduce nelle cellule tumorali un oligonucleotide sintetico complementare all'RNA stampo della ribonucleoproteina telomerasi umana (hTR). Prevedi e giustifica quale effetto avrà questo trattamento sull'attività della telomerasi, sulla lunghezza dei telomeri e sulla vitalità a lungo termine delle cellule tumorali.

Negli embrioni precoci dell'insetto Drosophila melanogaster, la fase S dura solo $5$ minuti, mentre nelle cellule somatiche adulte si prolunga per circa $8$ ore. Tuttavia, la velocità di avanzamento della forcella di replicazione è identica in entrambi gli stadi: circa $40$ nucleotidi al secondo. a) Se il genoma aploide di Drosophila ha $1,8 \cdot 10^8$ paia di basi, calcola la distanza media massima (in paia di basi) che può esserci tra due origini di replicazione attive adiacenti nell'embrione per completare la replicazione in $5$ minuti, assumendo una replicazione bidirezionale. b) Interpreta a che cosa è dovuta la differenza nella durata della fase S tra embrione e adulto se la velocità di polimerizzazione non cambia. c) Ragiona su quale rischio genomico comporterebbe per la cellula eucariote il fatto che una stessa origine di replicazione si riattivasse («scattasse») due volte all'interno di una stessa fase S e come la cellula previene questo evento.