La réplication de l'ADN

À quel moment du cycle cellulaire l'ADN est-il répliqué et pourquoi est-il indispensable que la réplication ait lieu avant le début de la division cellulaire ?

Après la réplication, chaque chromosome est constitué de deux chromatides sœurs. Expliquer quelle relation existe entre les séquences d'ADN des deux chromatides, pourquoi elles restent unies pendant un temps et à quel moment de la division cellulaire elles se séparent.

Que signifie le fait que la réplication de l'ADN soit semi-conservative ? Expliquer avec vos propres mots, en indiquant comment sont constituées les deux molécules d'ADN filles.

Avant la célèbre expérience de Meselson et Stahl, il existait trois modèles théoriques pour expliquer la duplication de l'ADN : semi-conservatif, conservatif et dispersif. Imaginer que vous réalisez cette expérience en cultivant des bactéries E. coli pendant de nombreuses générations dans un milieu contenant de l'azote lourd ($^{15}\text{N}$) jusqu'à ce que tout leur ADN soit marqué, puis en les transférant dans un milieu contenant de l'azote léger ($^{14}\text{N}$).

1. a) Déduire quels types de molécules d'ADN (lourdes $^{15}\text{N}\text{-}^{15}\text{N}$, hybrides $^{15}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$ ou légères $^{14}\text{N}\text{-}^{14}\text{N}$) et dans quelles proportions apparaîtraient dans le gradient de densité après une puis deux générations si la réplication était :

1. Strictement conservative.

2. Strictement dispersive.

1. b) Justifier lequel de ces deux modèles alternatifs a été écarté dès l'analyse de l'ADN de la première génération et lequel a nécessité d'attendre la deuxième génération pour être réfuté.

Pendant la réplication, quel nucléotide sera inséré en face d'une adénine du brin matrice ? Et en face d'une guanine ? Expliquer quelle propriété de la structure de l'ADN rend la copie fidèle.

Nommer l'enzyme principale qui synthétise le nouveau brin d'ADN pendant la réplication, expliquer sa fonction de base et dans quel sens (5'→3' ou 3'→5') elle ajoute les nucléotides.

Les nucléotides incorporés au nouveau brin arrivent sous forme de triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Expliquer d'où la cellule tire l'énergie nécessaire pour former les liaisons de la chaîne en cours d'élongation.

L'analyse chimique de l'ADN d'une espèce montre que $30\ \%$ de ses bases sont de l'adénine. Indiquer, en justifiant, les pourcentages de thymine, de guanine et de cytosine, et expliquer quelle conséquence cette relation de complémentarité a pour la réplication de l'ADN.

Combien de fourches de réplication se forment à partir d'une seule origine de réplication et dans quel sens avancent-elles ? Expliquer quel avantage représente le fait que les chromosomes eucaryotes possèdent de nombreuses origines de réplication.

Indiquer deux différences entre la réplication d'un chromosome bactérien et celle d'un chromosome humain, en considérant la forme de l'ADN et le nombre d'origines de réplication.

L'ADN polymérase d'E. coli ajoute environ $1000$ nucléotides par seconde à chaque fourche. Calculer le temps minimal nécessaire pour répliquer son chromosome circulaire de $4,6$ millions de paires de bases s'il est répliqué à partir d'une seule origine de façon bidirectionnelle, et commenter le résultat en le comparant au temps de génération de la bactérie (environ $20$ minutes).

Chez les embryons précoces de l'insecte Drosophila melanogaster, la phase S ne dure que $5$ minutes, alors que dans les cellules somatiques adultes elle se prolonge pendant environ $8$ heures. Pourtant, la vitesse d'avancée de la fourche de réplication est identique aux deux stades : environ $40$ nucléotides par seconde. a) Si le génome haploïde de la drosophile compte $1,8 \cdot 10^8$ paires de bases, calculer la distance moyenne maximale (en paires de bases) pouvant séparer deux origines de réplication actives adjacentes chez l'embryon pour achever la réplication en $5$ minutes, en supposant une réplication bidirectionnelle. b) Interpréter la cause de la différence de durée de la phase S entre l'embryon et l'adulte si la vitesse de polymérisation ne change pas. c) Expliquer quel risque génomique représenterait, pour la cellule eucaryote, l'activation (« déclenchement ») d'une même origine de réplication deux fois au cours d'une même phase S, et comment la cellule prévient cet événement.

Nommer l'enzyme qui ouvre la double hélice d'ADN au niveau de la fourche de réplication, expliquer quel problème mécanique apparaît dans la molécule en avant de la fourche (surenroulement) et quel type d'enzyme le résout.

Expliquer le rôle de l'amorce d'ARN au début de la réplication et justifier pourquoi l'ADN polymérase ne peut pas initier un nouveau brin à partir de rien.

Nommer l'enzyme qui synthétise les amorces d'ARN pendant la réplication et expliquer pourquoi chaque fragment d'Okazaki a besoin de sa propre amorce alors que le brin précoce n'en nécessite qu'une seule au début.

Dans une fourche de réplication, l'un des nouveaux brins (A) est synthétisé de façon continue en avançant vers la fourche, tandis que l'autre (B) est synthétisé par fragments en s'éloignant d'elle. Indiquer lequel des nouveaux brins (A ou B) est le brin précoce et lequel est le brin tardif, et expliquer pourquoi l'un est synthétisé de façon continue et l'autre en fragments d'Okazaki, en faisant référence au sens dans lequel agit l'ADN polymérase.

Ordonner les étapes suivantes de la réplication et justifier l'ordre choisi : jonction des fragments par l'ADN ligase, ouverture de la double hélice par l'hélicase, synthèse de nucléotides par l'ADN polymérase, élimination des amorces, formation des fragments d'Okazaki.

Une fois les amorces d'ARN éliminées du brin tardif, par quoi les lacunes sont-elles comblées et quelle enzyme scelle ensuite la chaîne ? Expliquer pourquoi le brin tardif met plus de temps à être achevé que le brin précoce.

Pour analyser la synthèse des nouveaux brins d'ADN pendant la réplication, on réalise un essai de marquage-chasse (pulse-chase) sur une culture bactérienne : les cellules sont exposées à de la thymidine radioactive ($[^3\text{H}]\text{-thymidine}$) pendant une impulsion ultracourte de $5$ secondes, puis transférées dans un milieu contenant un excès de thymidine non radioactive (chasse) pendant $5$ minutes. Après lyse et dénaturation alcaline, les chaînes d'ADN sont séparées par gradient de densité en centrifugeuse. a) Prédire et justifier le profil de taille des fragments radioactifs (petits, d'environ $1000$-$2000$ nucléotides, ou de masse moléculaire élevée) observé à la fin de l'impulsion ($5$ s) et son évolution après la chasse ($5$ min). b) Si le même essai est réalisé sur une souche mutante dont l'ADN ligase est bloquée thermiquement, prédire le résultat après les $5$ minutes de chasse et justifier la réponse. c) Expliquer pourquoi cette expérience réfute l'hypothèse selon laquelle les deux brins seraient synthétisés de façon continue.

On isole un mutant thermosensible de levure pour le gène codant l'ADN ligase I. À $25\text{ }^\circ\text{C}$, la levure se divise normalement, mais lorsqu'elle est cultivée à $37\text{ }^\circ\text{C}$, l'enzyme est inactivée et la cellule arrête son cycle cellulaire avant d'entrer en mitose. a) Un élève affirme : « À $37\text{ }^\circ\text{C}$, seul le brin tardif présentera des coupures car c'est là que se forment les fragments d'Okazaki ; le brin précoce sera une chaîne unique parfaitement continue d'une extrémité à l'autre du chromosome ». Réfuter cette affirmation en tenant compte de la présence de multiples origines de réplication (réplicons) par chromosome linéaire. b) Préciser le type exact de liaison chimique qui ne peut pas être scellée en l'absence de ligase (en indiquant les groupes chimiques terminaux $3'$ et $5'$) et expliquer pourquoi les ADN polymérases ne peuvent pas réaliser seules cette réaction de scellement. c) Justifier pourquoi la présence de coupures non scellées dans la double hélice active un point de contrôle du cycle cellulaire empêchant la mitose.

Pour vérifier si la réplication est continue ou discontinue, des chercheurs réalisent un marquage à la thymidine tritiée pendant des impulsions de $5$, $15$ et $60$ secondes chez des bactéries. Après dénaturation de l'ADN, ils analysent la taille des chaînes radioactives par centrifugation. À $5$ secondes, ils ne détectent que des fragments courts ($1000$-$2000$ nucléotides), mais à mesure que le temps de marquage augmente, la radioactivité se déplace progressivement vers des fragments de grande masse moléculaire. a) Expliquer pourquoi ce résultat étaye l'idée que la réplication est semi-discontinue et non continue sur les deux brins. b) Prédire et justifier le résultat qui aurait été obtenu pour les trois mesures si les deux brins étaient synthétisés de façon continue à partir de l'origine de réplication. c) Expliquer la cause moléculaire obligatoire (structurale et enzymatique) pour laquelle la cellule est contrainte de synthétiser l'un des deux brins sous forme de petits fragments.

En laboratoire, on obtient une souche mutante d'Escherichia coli qui présente une altération de l'ADN polymérase III : elle conserve intacte sa vitesse de polymérisation dans le sens $5'\to 3'$, mais a totalement perdu son activité exonucléase $3'\to 5'$. a) Prédire et justifier l'effet de cette mutation sur la fidélité de la copie et sur le taux de mutations spontanées par division cellulaire. b) Si l'on cultive cette souche en présence de 2-aminopurine (un analogue de base pouvant s'apparier de façon incorrecte avec la cytosine), déterminer, en justifiant, si le taux de fixation des mutations sera plus élevé, plus faible ou identique à celui de la souche sauvage. c) Justifier au niveau moléculaire pourquoi l'activité de relecture doit retirer le nucléotide erroné dans le sens $3'\to 5'$ avant de poursuivre l'ajout du nucléotide suivant.

La réplication de l'ADN atteint une fidélité extraordinaire grâce à trois barrières successives : la spécificité d'appariement de l'ADN polymérase (erreur de $1$ tous les $10^5$ nucléotides), la relecture par l'exonucléase $3'\to 5'$ (erreur finale de $1$ tous les $10^7$) et le système post-réplicatif de réparation des mésappariements (mismatch repair, erreur finale de $1$ tous les $10^9$). a) Une lignée cellulaire de cancer colorectal héréditaire (syndrome de Lynch) présente un taux de mutation $100$ fois supérieur à la normale, bien que ses ADN polymérases aient des activités polymérase et exonucléase intactes. Déduire et justifier quel mécanisme est défaillant dans ces cellules. b) Pour corriger une erreur après le passage de la fourche, le système de réparation doit distinguer le brin matrice (ancien) du brin nouvellement synthétisé. Expliquer comment la machinerie cellulaire parvient à discriminer les deux brins pour éviter de remplacer la base du brin d'origine. c) Si une erreur d'appariement (par exemple une guanine face à une thymine) échappe à tous les systèmes de correction et que la cellule effectue deux cycles complets de division cellulaire, déduire quelle proportion des molécules d'ADN filles finales portera la mutation définitivement fixée.

On compare en laboratoire deux cultures de cellules humaines : des fibroblastes dermiques normaux et des cellules cancéreuses d'une lignée de carcinome pulmonaire. Au cours de $60$ doublements de population, on suit la longueur moyenne des télomères. Les fibroblastes entrent en sénescence réplicative au doublement $40$ avec un raccourcissement télomérique progressif, tandis que les cellules cancéreuses prolifèrent de façon continue et conservent intacte la longueur de leurs télomères. a) Justifier au niveau moléculaire pourquoi la machinerie de réplication conventionnelle ne peut pas achever l'extrémité $5'$ du brin tardif après l'élimination de la dernière amorce d'ARN (le « problème de la réplication des extrémités »). b) On conçoit une thérapie qui introduit dans les cellules tumorales un oligonucléotide synthétique complémentaire de l'ARN matrice de la ribonucléoprotéine télomérase humaine (hTR). Prédire et justifier l'effet de ce traitement sur l'activité de la télomérase, la longueur des télomères et la viabilité à long terme des cellules tumorales.