Durante la pandemia, los laboratorios de Chile confirmaban un contagio de coronavirus con un test PCR a partir de una muestra mínima tomada con un hisopo. Y para que una bacteria fabrique insulina humana, hay que poder copiar, cortar, pegar y leer el ADN. Hace unas décadas era un trabajo de años; hoy un laboratorio lo hace en una tarde. En esta página vas a conocer las herramientas que lo hacen posible: PCR, electroforesis, enzimas de restricción, clonación molecular y CRISPR-Cas9.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En una escena de crimen que analiza el Servicio Médico Legal, o en un resto óseo, a veces solo hay una cantidad mínima de ADN, insuficiente para analizarla. ¿Cómo conseguir millones de copias idénticas del fragmento que interesa, sin usar células vivas?
Si cada ciclo duplica las copias, después de $n$ ciclos hay $2^n$ moléculas por cada molécula inicial. Con 30 ciclos son más de mil millones ($2^{30} \approx 1{,}07 \cdot 10^9$).
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¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para qué se utiliza? Nombra dos situaciones prácticas en las que resulte imprescindible amplificar ADN.
¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para qué se utiliza? Nombra dos situaciones prácticas en las que resulte imprescindible amplificar ADN.
En un laboratorio se pretende amplificar un gen humano mediante PCR, pero por error un técnico utiliza ADN polimerasa I purificada de Escherichia coli en lugar de la…
En un laboratorio se pretende amplificar un gen humano mediante PCR, pero por error un técnico utiliza ADN polimerasa I purificada de Escherichia coli en lugar de la polimerasa Taq habitual de Thermus aquaticus.
a) Si se aplica el programa térmico estándar ($95\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$, $55\ \text{°C}$ durante $30\ \text{s}$ y $72\ \text{°C}$ durante $1\ \text{min}$, repetido 30 veces), predice qué resultado se obtendrá en la electroforesis en gel de agarosa y justifica molecularmente qué le sucede a la enzima de E. coli durante el primer ciclo.
b) En los inicios de la técnica, antes del aislamiento de polimerasas termófilas, la PCR se realizaba con ADN polimerasa I de E. coli. Diseña la modificación del protocolo experimental que debían llevar a cabo los investigadores en cada uno de los 30 ciclos para lograr la amplificación y explica qué inconvenientes prácticos planteaba.
c) La polimerasa Taq carece de actividad exonucleasa 3' $\rightarrow$ 5', a diferencia de otras polimerasas termoestables como Pfu. Justifica cuál de las dos enzimas es más idónea para amplificar un gen con fines terapéuticos donde no se toleren errores de secuencia, explicando la función de dicha actividad enzimática.
El ciclo de la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión
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El esquema muestra un ciclo de PCR con sus tres pasos numerados y la temperatura de cada uno. Explica qué ocurre en cada paso y razona por qué cada uno requiere su…
El esquema muestra un ciclo de PCR con sus tres pasos numerados y la temperatura de cada uno. Explica qué ocurre en cada paso y razona por qué cada uno requiere su temperatura característica.
Para amplificar por PCR un fragmento de ADN bicatenario diana, se conoce la secuencia de los extremos de una de sus hebras (leída en sentido 5' $\rightarrow$ 3'):…
Para amplificar por PCR un fragmento de ADN bicatenario diana, se conoce la secuencia de los extremos de una de sus hebras (leída en sentido 5' $\rightarrow$ 3'):
5'-ATGCCGTAG... [fragmento diana de $600\ \text{pb}$] ...ACGTTCGAT-3'
a) Diseña la secuencia y la polaridad (5' $\rightarrow$ 3') de los dos cebadores de ADN (de 9 nucleótidos cada uno) necesarios para amplificar dicha región. Justifica por qué ambos cebadores deben tener secuencias distintas y orientarse en sentidos convergentes.
b) Un estudiante programa el termociclador con los siguientes ciclos: $60\ \text{°C}$ (anillamiento) y $72\ \text{°C}$ (elongación), omitiendo intencionalmente el paso a $95\ \text{°C}$. Tras 30 ciclos, analiza la muestra por electroforesis y no observa ninguna banda. Justifica a nivel molecular la causa del fracaso.
c) Si se parte de 2 moléculas de ADN bicatenario iniciales y la reacción tiene una eficiencia teórica del $100\ \%$, deduce cuántas moléculas bicatenarias que contengan exclusivamente la longitud exacta delimitada por los cebadores se habrán generado al completarse el tercer ciclo de la PCR. Justifica tu respuesta razonando paso a paso qué ocurre en cada ciclo.
Después de una PCR o de un corte con enzimas, ¿cómo se sabe qué fragmentos de ADN hay en el tubo y de qué tamaño son? Se los separa por electroforesis en gel.
El ADN tiene carga negativa (por los grupos fosfato). Se siembra la muestra en un gel poroso, se aplica una corriente eléctrica y los fragmentos migran hacia el polo positivo. El gel actúa como un tamiz: los fragmentos pequeños avanzan más rápido y llegan más lejos; los grandes quedan más cerca de donde se sembró. Al teñir el ADN se ven bandas, una por cada tamaño de fragmento.
Para leer un gel se compara cada banda con las del marcador (un conjunto de fragmentos de tamaño conocido). En la muestra 1 hay dos bandas; en la muestra 2 hay tres bandas, y las tres coinciden con las del marcador. Esto es lo que se hace al comparar perfiles genéticos: si dos muestras tienen las mismas bandas, tienen el mismo patrón de fragmentos.
Enzimas de restricción: tijeras moleculares
Cuando un virus que ataca bacterias (un bacteriófago) inyecta su ADN en una bacteria, ese ADN a veces es cortado en pedazos y el ADN de la propia bacteria queda intacto. ¿Cómo reconoce la bacteria lo que debe cortar?
También sirven para analizar ADN: cortar una muestra con una enzima y separar los fragmentos por electroforesis produce un patrón de bandas que depende de dónde estén las secuencias de corte.
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¿Qué son las enzimas de restricción, de qué organismos se obtienen y cuál es su función en la ingeniería genética?
¿Qué son las enzimas de restricción, de qué organismos se obtienen y cuál es su función en la ingeniería genética?
Antes se obtenía la insulina para tratar la diabetes a partir de páncreas de animales, con costos altos y riesgo de reacciones alérgicas. En Chile, el científico Pablo Valenzuela usó estas mismas herramientas para desarrollar una vacuna recombinante contra la hepatitis B. ¿Cómo lograr que una bacteria fabrique de forma ilimitada una proteína humana?
Un ejemplo es la bacteria que produce insulina humana. Para obtener un transgénico se aísla el gen de interés, se lo inserta en un vector y se lo introduce en las células del organismo receptor; en bacterias se usa un plásmido. En plantas, por ejemplo, se suele usar una bacteria del suelo (Agrobacterium) o se dispara el ADN a las células, y luego se regenera una planta completa a partir de las células modificadas. Cómo se usan estos organismos y qué debates generan se trata en el apartado de aplicaciones.
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¿Qué es un organismo transgénico? Pon un ejemplo y explica, en líneas generales, cómo se obtiene.
¿Qué es un organismo transgénico? Pon un ejemplo y explica, en líneas generales, cómo se obtiene.
Ordena los pasos necesarios para clonar un gen humano en bacterias y justifica el orden: introducir el plásmido recombinante en la bacteria, cortar el gen y el plásmido…
Ordena los pasos necesarios para clonar un gen humano en bacterias y justifica el orden: introducir el plásmido recombinante en la bacteria, cortar el gen y el plásmido con la misma enzima de restricción, unir el gen al plásmido con ADN ligasa, seleccionar y multiplicar las bacterias transformadas.
Un grupo de investigación quiere sintetizar la hormona peptídica insulina en la bacteria Escherichia coli. Para ello, aíslan directamente el gen de la insulina a partir…
Un grupo de investigación quiere sintetizar la hormona peptídica insulina en la bacteria Escherichia coli. Para ello, aíslan directamente el gen de la insulina a partir del ADN nuclear de células pancreáticas humanas y lo insertan en un plásmido bacteriano junto a un promotor eficaz de E. coli.
a) Tras introducir el plásmido en las bacterias, comprueban que se sintetiza un polipéptido aberrante, inactivo y de tamaño incorrecto. Explica por qué el ADN genómico eucariota no puede expresarse adecuadamente en una bacteria, haciendo referencia a la estructura del gen y a la maquinaria de procesamiento del ARN.
b) Diseña la estrategia biotecnológica para resolver este problema: indica qué molécula debes aislar como molde inicial, qué tipo de cebador sintético específico emplearías aprovechando una modificación postranscripcional de dicha molécula y qué enzima de origen vírico utilizarás para sintetizar la primera hebra de ADN complementario (ADNc).
c) Al comparar la secuencia del ADNc obtenido con la del gen nuclear inicial, se comprueba que el ADNc es mucho más corto y carece de la secuencia promotora original humana. Explica por qué ocurre esto y justifica cómo se consigue que la bacteria transcriba dicho ADNc una vez clonado en el plásmido.
CRISPR-Cas9 permite editar el genoma con gran precisión. Explica de forma sencilla qué función cumple el ARN guía y qué función cumple la proteína Cas9 en esta técnica.
CRISPR-Cas9 permite editar el genoma con gran precisión. Explica de forma sencilla qué función cumple el ARN guía y qué función cumple la proteína Cas9 en esta técnica.
Vuelve al principio: para confirmar un contagio se amplifica por PCR el material genético del virus de una muestra mínima, y para identificar a una persona se comparan las bandas en un gel; para que una bacteria fabrique insulina humana se corta, se pega y se clona el gen.
¡A practicar! 3 ejercicios de nivel medio en este apartado