Exercicis: L'extracció de l'ADN

Explica amb les teves paraules què significa extreure l'ADN d'una cèl·lula eucariota i cita dos materials senzills dels quals es poden obtenir les cèl·lules per a la pràctica (per exemple, la mucosa de la galta o una fruita). Per què convé triturar bé el material abans de començar?

En la pràctica d'extracció d'ADN s'utilitzen un rentavaixelles, sal i alcohol molt fred. Explica el paper de cada reactiu: quines estructures de la cèl·lula dissol el rentavaixelles, per a què serveix la sal i què li passa a l'ADN quan entra en contacte amb l'alcohol.

Observa l'esquema del tub d'assaig al final de la pràctica d'extracció d'ADN. Identifica què assenyalen els marcadors ?1, ?2 i ?3 (la capa d'alcohol, l'extracte aquós amb l'ADN dissolt i els filaments d'ADN que apareixen a la zona de contacte) i explica per què l'ADN es concentra precisament en aquesta zona.

Raona per què per extreure ADN serveix gairebé qualsevol teixit, per exemple una fulla d'enciam o un tros de pollastre, sempre que les seves cèl·lules tinguin nucli. Què tenen en comú totes aquestes cèl·lules?

Després de triturar el material amb la barreja d'extracció, la pràctica continua filtrant el conjunt. Explica què es reté al filtre, què passa al vas i per què interessa desfer-se de la part sòlida.

Enumera el material de laboratori necessari per a la pràctica d'extracció d'ADN (vas de precipitats, colador o filtre, tub d'assaig, vareta de vidre) i explica per a què s'utilitza cadascun.

Al tub, l'ADN passa d'estar dissolt a l'extracte a formar un precipitat de filaments en afegir-hi l'alcohol. Explica si la molècula d'ADN ha canviat químicament en aquest procés o només ha canviat el seu estat físic, i compara-ho amb el que li passa a la sal quan precipita a l'aigua.

Tot i que la pràctica utilitza ingredients de cuina, es fa en un laboratori. Cita dues normes de seguretat que has de respectar (per exemple, no tastar res i mantenir l'alcohol lluny de qualsevol flama) i explica el motiu de cadascuna.

Aquests passos de la pràctica d'extracció d'ADN estan desordenats: afegir l'alcohol molt fred per les parets del tub sense agitar; triturar el material; preparar la barreja d'aigua, sal i rentavaixelles; filtrar el conjunt; recollir els filaments d'ADN amb una vareta. Ordena'ls i justifica per què cada pas ha d'anar en aquesta posició.

L'alcohol de la pràctica ha d'estar molt fred i cal abocar-lo amb compte, de manera que formi una capa sobre l'extracte sense barrejar-s'hi. Explica quin avantatge té que l'alcohol estigui fred per a la solubilitat de l'ADN i per què convé que les dues capes no es barregin.

Al final de la pràctica apareix, a la zona de contacte entre l'extracte i l'alcohol, una mena de núvol blanquinós format per filaments. Descriu què s'observa i explica què és realment aquest material —no és una única molècula ni l'ADN d'una sola cèl·lula— i per què és visible a simple vista si una molècula d'ADN no ho és.

Un company proposa extreure ADN humà a partir d'una gota de sang. Raona per què els glòbuls vermells no serveixen per a aquesta pràctica i quines cèl·lules de la sang s'haurien d'utilitzar en comptes d'aquests.

El rentavaixelles dissol les membranes cel·lulars perquè estan formades per una bicapa de fosfolípids. Explica l'analogia amb el que fa el rentavaixelles en rentar un plat greixós i què li passa aleshores al contingut de la cèl·lula.

Dissenya un experiment per comprovar de quina fruita, entre plàtan, kiwi i maduixa, s'obté més ADN amb el mateix protocol. Indica quines variables mantindries constants perquè la comparació sigui justa i quina mesuraries per comparar els resultats.

Una cèl·lula humana conté uns $6\ \text{pg}$ d'ADN ($6 \cdot 10^{-12}\ \text{g}$). Estima quantes cèl·lules caldrien per obtenir $1\ \text{mg}$ d'ADN i raona per què a la pràctica cal triturar una bona quantitat de material.

L'ADN és soluble a l'extracte aquós amb sal, però insoluble en alcohol fred, mentre que moltes proteïnes i restes de membrana es queden al líquid. Explica la diferència entre dissoldre i precipitar, i per què aquest canvi de solubilitat permet separar l'ADN de gran part de les impureses.

Vols extreure ADN d'una maduixa i d'una ceba aplicant el mateix protocol. Raona quins ajustos podries necessitar en el triturat o en la quantitat de rentavaixelles segons la duresa de cada teixit, i prediu de quina esperes obtenir més ADN visible, sabent que la maduixa és octoploide: les seves cèl·lules tenen vuit jocs de cromosomes en lloc de dos.

Durant la pràctica d'extracció d'ADN vegetal, tres grups obtenen resultats fallits:

• Grup A: Va triturar el teixit vegetal en una batedora a màxima potència durant deu minuts i no observa brins, només un líquid tèrbol sense filaments definits.

• Grup B: Va afegir alcohol al 96 % a temperatura ambient ($22\ ^\circ\text{C}$) en lloc de refredar-lo prèviament a $-20\ ^\circ\text{C}$, i gairebé no observa precipitat a la interfase.

• Grup C: Va agitar enèrgicament amb una vareta el tub d'assaig tot just després d'abocar l'alcohol i les fibres que començaven a agrupar-se es van desfer.

Justifica què ha passat a escala física o molecular en cada cas per explicar el fracàs de l'extracció.

En una investigació forense es recull una minúscula mostra biològica (un cabell amb arrel que conté tot just unes desenes de cèl·lules). Un alumne afirma: «Podem fer servir el protocol casolà de la maduixa: triturem, afegim rentavaixelles, sal i alcohol, i després llegim els gens amb una lupa». Rebat la seva afirmació identificant tres limitacions insalvables d'aquest mètode escolar i justifica quines tècniques avançades (com l'amplificació per PCR o la purificació enzimàtica) són imprescindibles en un laboratori real per analitzar la mostra.

Un grup d'alumnes vol adaptar el protocol d'extracció d'ADN vegetal a teixit animal (pit de pollastre). Proposen suprimir dos passos: el triturat mecànic inicial (perquè la carn és més tova que una paret vegetal) i l'addició de detergent (perquè les cèl·lules animals no tenen paret cel·lular).

Avalua críticament les dues propostes: justifica si és encertat prescindir de cadascun d'aquests passos en funció de l'organització de les cèl·lules animals i prediu què obtindrien si eliminessin el detergent.

En acabar la pràctica amb maduixa i amb kiwi, un alumne compara tots dos tubs i afirma: «L'ADN de les dues fruites es veu exactament igual (una massa blanquinosa i filamentosa). Això demostra que a nivell molecular l'ADN de totes les espècies és idèntic i que l'extracció no serveix per diferenciar-les». Rebat la seva conclusió distingint quina part de la molècula d'ADN és universal per a tots els éssers vius i quina és la que realment conté la informació que permet a un laboratori seqüenciar i identificar l'espècie.

Per identificar un sospitós, un laboratori talla les mostres d'ADN amb enzims i sotmet els fragments a electroforesi en un gel d'agarosa:

1. a) Si l'ADN té càrrega neta negativa a causa dels seus grups fosfat, dedueix raonadament cap a quin pol elèctric (positiu o negatiu) migraran els fragments en connectar el corrent.
2. b) Si una mostra conté fragments d'ADN de $300$ parells de bases i d'altres de $2500$ parells de bases, prediu quins quedaran més allunyats del pouet de càrrega a la malla del gel i justifica el motiu físic.
3. c) Interpreta què significaria que el patró de bandes del sospitós coincideixi exactament en posició i nombre amb el de la mostra trobada al lloc del delicte.

L'ADN obtingut amb el protocol escolar no és pur: precipita juntament amb proteïnes (histones) i lípids. Un equip proposa afegir suc de pinya natural (ric en bromelaïna, un enzim proteasa) al filtrat abans d'afegir l'alcohol. Un altre equip proposa escalfar el filtrat a $100\ ^\circ\text{C}$ durant $15$ minuts per eliminar les impureses proteiques.

Avalua ambdues propostes: justifica quina de les dues és adequada explicant l'acció de la proteasa sobre les histones, i prediu l'efecte contraproduent que tindria bullir la mostra sobre la molècula d'ADN.

Una molècula d'ADN té un gruix d'uns $2\ \text{nm}$, mentre que els filaments que es veuen a la pràctica mesuren unes dècimes de mil·límetre, per exemple $0{,}5\ \text{mm}$. Estima quantes molècules d'ADN agrupades caben en el gruix d'un filament i relaciona el resultat amb el fet que l'ADN precipitat sigui visible a simple vista.