Esercizi: La regolazione genica e i genomi

Tutte le cellule del tuo corpo possiedono lo stesso DNA, eppure un neurone e una cellula muscolare sono molto diversi. Spiega a che cosa è dovuta questa differenza facendo riferimento all'espressione genica.

Che cos'è un gene costitutivo e che cos'è un gene regolabile? Fai un esempio di ciascun tipo e spiega perché conviene alla cellula regolare alcuni dei suoi geni.

Indica due differenze generali tra il genoma di una cellula procariote e quello di una cellula eucariote (localizzazione, forma del DNA, presenza di introni).

Che cos'è un operone? Indica in quali tipi di organismi si trova e nomina i componenti di base di un operone inducibile come l'operone lac.

Definisci introne ed esone e indica che cosa accade agli uni e agli altri durante la maturazione dell'mRNA nelle cellule eucariote.

Che cos'è un fattore di trascrizione? Spiega brevemente quale ruolo svolge nella regolazione dell'espressione genica e a quali regioni del DNA si lega.

Che cosa significa che un gene è silenziato in una cellula? Spiega un modo in cui la cellula può impedire che un determinato gene venga trascritto.

Il genoma umano contiene circa $20000$ geni codificanti proteine, ma questi occupano solo una piccola parte del DNA totale. Indica quali altri tipi di sequenze contiene il genoma e quali funzioni si attribuiscono ad alcune delle regioni non codificanti.

Lo schema rappresenta l'operone lac di Escherichia coli in due situazioni (A e B). Indica in quale delle due è presente lattosio nel terreno, nomina gli elementi indicati (P, O, Z-Y-A e ?) e spiega che cosa accade all'espressione dei geni strutturali in ciascuna situazione.

Che cos'è un promotore e quale ruolo svolge nella regolazione della trascrizione? Spiega che cosa può accadere se una mutazione rende inutilizzabile il promotore di un gene.

Nelle cellule eucariote il DNA si impacchetta legandosi agli istoni e formando la cromatina. Spiega come influisce il grado di compattazione della cromatina sull'espressione dei geni.

Un ceppo di E. coli cresce in un terreno con glucosio e senza lattosio. Spiega quale sarà lo stato dell'operone lac in quelle condizioni e descrivi che cosa accadrà all'espressione dei suoi geni strutturali quando il glucosio si esaurirà e verrà aggiunto lattosio al terreno.

Nelle cellule eucariote esistono sequenze regolatrici chiamate enhancer (potenziatori) che possono trovarsi a migliaia di paia di basi dal gene che regolano. Spiega come possono agire a tanta distanza, facendo riferimento al ripiegamento della cromatina e ai fattori di trascrizione.

I microRNA sono piccoli RNA che non codificano proteine ma regolano l'espressione genica. Spiega come agiscono sugli mRNA bersaglio, se il loro effetto è attivatore o inibitore e perché sono considerati un livello di regolazione post-trascrizionale.

Confronta la regolazione dell'espressione genica nei procarioti e negli eucarioti (numero di livelli di controllo, velocità di risposta all'ambiente, organizzazione dei geni) e spiega perché nelle cellule eucariote esistono più punti possibili di regolazione.

Solo circa il $1,5\ \%$ del genoma umano corrisponde a sequenze codificanti proteine. Calcola a quante paia di basi equivale quella percentuale in un genoma di $3 \cdot 10^9$ paia di basi e spiega che cosa si sa oggi del resto del genoma (sequenze regolatrici, introni, elementi mobili, ripetizioni).

In una biopsia di carcinoma colorettale si rileva che il gene oncosoppressore MLH1 è completamente silenziato, il che impedisce la riparazione dei appaiamenti errati nel DNA. Sequenziando il gene nel tumore, la sua sequenza nucleotidica risulta identica a quella del tessuto sano; tuttavia, un'analisi molecolare rivela una densa ipermetilazione di citosine nelle isole CpG della sua regione promotrice. Coltivando le cellule tumorali con 5-azacitidina (inibitore delle DNA metiltransferasi), l'espressione di MLH1 riprende.

1. a) A partire da questi dati, giustifica perché il silenziamento di MLH1 in questo tumore costituisce un evento epigenetico e non una mutazione genetica.
2. b) Spiega il meccanismo fisico-molecolare per cui la presenza di gruppi metilici nelle citosine del promotore impedisce la trascrizione del gene, facendo riferimento al legame dei fattori di trascrizione e al rimodellamento della cromatina.
3. c) Quando queste cellule tumorali trattate con 5-azacitidina si dividono in un terreno privo del farmaco, le nuove generazioni cellulari possono ereditare il profilo di metilazione e silenziare di nuovo il gene. Giustifica come la metilazione del DNA si mantiene e si trasmette durante la replicazione cellulare grazie alle metiltransferasi di mantenimento.

Analizza la seguente tabella con dati genomici di tre organismi rappresentativi:

1. a) Uno studente afferma che, poiché Paris japonica ha un genoma quasi 50 volte maggiore di quello umano, deve possedere una complessità biologica e anatomica proporzionalmente superiore. Confuta la sua affermazione a partire dai dati e spiega in che cosa consiste il paradosso del valore C.
2. b) Alla luce dei dati della tabella, spiega quali tipi di sequenze costituiscono la gran parte del DNA non codificante negli eucarioti e perché un batterio non può tollerare una proporzione così elevata di DNA non codificante.

In un laboratorio si studia un ceppo mutante di Escherichia coli che presenta una delezione completa nel gene regolatore lacI (fenotipo I⁻). Un allievo prevede che questo batterio trascriverà al massimo i geni strutturali dell'operone lac in qualsiasi circostanza, poiché il repressore non si legherà mai all'operatore.

Per mettere alla prova la sua ipotesi, il ceppo viene coltivato in tre terreni con concentrazioni equivalenti di nutrienti di base:

• Terreno A: glucosio come unica fonte di carbonio.

• Terreno B: presenza simultanea di glucosio e lattosio.

• Terreno C: lattosio come unica fonte di carbonio.

1. a) Valuta se la previsione dell'allievo è corretta. Giustifica quale livello di trascrizione dell'operone (nullo, basale molto basso o alto) si osserverà in ciascuno dei tre terreni, descrivendo il meccanismo molecolare coinvolto (ruolo del complesso CAP-cAMP e dell'adenilato ciclasi).
2. b) Prevedi con argomenti che cosa accadrebbe alla trascrizione nel Terreno C se il ceppo subisse una seconda mutazione che inattivasse il gene della proteina CAP.

Nei batteri aploidi, sia una mutazione nulla nel gene del repressore (I⁻) sia una mutazione puntiforme nella sequenza dell'operatore (Oᶜ) impediscono la repressione dell'operone lac, dando luogo a un fenotipo costitutivo in assenza di lattosio.

Per distinguere i due meccanismi, François Jacob e Jacques Monod generarono ceppi diploidi parziali (merozigoti) mediante plasmidi F'. Analizza i due ceppi seguenti:

• Ceppo 1: I⁺ Oᶜ Z⁺ / I⁺ O⁺ Z⁻

• Ceppo 2: I⁺ O⁺ Z⁻ / I⁻ O⁺ Z⁺

(dove Z⁺ codifica una β-galattosidasi funzionale e Z⁻ un enzima non funzionale).

1. a) Prevedi con argomenti se verrà prodotta β-galattosidasi attiva nel Ceppo 1 e nel Ceppo 2 coltivandoli in un terreno privo di lattosio.
2. b) A partire dalla tua previsione, classifica il repressore e l'operatore come regolatori che agiscono in cis o in trans, giustificando la differenza molecolare tra i due tipi di controllo.

In un esperimento con epatociti in coltura si confronta il meccanismo d'azione di due ormoni: l'adrenalina (ormone idrosolubile che agisce mediante un recettore di membrana accoppiato a proteina G) e il cortisolo (ormone steroideo liposolubile che si lega a un recettore intracellulare).

Per indagare la via di segnalazione, si aggiunge a metà delle colture l'actinomicina D (un potente inibitore della trascrizione che blocca la RNA polimerasi II). In seguito si misura la risposta cellulare (attivazione enzimatica e sintesi di glucosio) nel tempo.

1. a) Interpreta e giustifica perché la risposta cellulare scatenata dall'adrenalina impiega solo secondi o minuti a manifestarsi, mentre quella del cortisolo richiede diverse ore.
2. b) Prevedi come influirà la presenza di actinomicina D sulla risposta generata da ciascuno dei due ormoni. Motiva la risposta a livello molecolare.
3. c) Spiega perché, dopo aver lavato il terreno e rimosso entrambi gli ormoni, gli effetti metabolici indotti dal cortisolo persistono per un tempo molto più lungo di quelli dell'adrenalina.

Alla fine dell'Ottocento, August Weismann propose che il differenziamento cellulare durante lo sviluppo embrionale avvenisse per una perdita selettiva e progressiva di geni: ogni linea cellulare conserverebbe solo il DNA necessario a svolgere la propria funzione specializzata.

1. a) Descrivi il fondamento di un esperimento storico (come il trasferimento nucleare negli anfibi di Gurdon o la clonazione della pecora Dolly) e spiega come i suoi risultati abbiano confutato definitivamente l'ipotesi di Weismann.
2. b) Se un neurone e un epatocito di uno stesso individuo umano adulto possiedono esattamente lo stesso genoma, giustifica quali meccanismi molecolari (fattori di trascrizione specifici e modificazioni epigenetiche come la metilazione del DNA e l'acetilazione degli istoni) permettono a ciascuno di esprimere un insieme di proteine in larga parte diverso e di mantenere la propria identità in modo stabile.

In Drosophila melanogaster, la mutazione dominante a guadagno di funzione Antennapedia (Antp) fa sì che il gene Antp, la cui espressione normale è limitata al secondo segmento toracico per indurre lo sviluppo delle zampe, venga trascritto erroneamente nei dischi imaginali della testa. Di conseguenza, i moscerini sviluppano zampe completamente formate al posto delle antenne.

1. a) A partire da questo caso, deduci quale funzione molecolare svolgono le proteine codificate dai geni omeotici (Hox) e spiega come l'attivazione di un solo gene sia in grado di scatenare la morfogenesi coordinata di un intero appendice.
2. b) Un allievo formula l'ipotesi che, se si isola un moscerino con una mutazione nulla per delezione di Antp in omozigosi (perdita totale di funzione), l'embrione nascerà senza testa. Confuta questa ipotesi e prevedi con argomenti quale alterazione anatomica ti aspetteresti di osservare nel torace di tale individuo.

Un gruppo di biotecnologia progetta un plasmide affinché Escherichia coli produca insulina umana ricombinante. Nel primo tentativo ha clonato direttamente il gene umano estratto dal DNA nucleare (con i suoi introni ed esoni) insieme a un forte promotore batterico costitutivo. Il risultato è stato un fallimento: la coltura cellulare è morta prematuramente per accumulo tossico di proteina anomala non funzionale.

1. a) Identifica i due errori fondamentali commessi nella progettazione e spiega le cause biologiche e molecolari di tale fallimento.
2. b) Riprogetta la strategia utilizzando il sistema di regolazione dell'operone lac: indica quale tipo di acido nucleico devono impiegare come stampo per la sequenza codificante, quali elementi regolatori batterici indispensabili devono includere nel vettore di espressione e come controlleranno nel tempo l'induzione nel fermentatore affinché il batterio raggiunga prima un'alta densità cellulare prima di iniziare la sintesi proteica.