Exercices: Culture et contrôle des micro-organismes

Qu'est-ce qu'un milieu de culture et quelles conditions (nutriments, température, pH, dioxygène) contrôle-t-on lors de la culture de bactéries au laboratoire ? Indiquer la différence entre un milieu solide et un milieu liquide.

Différencier stérilisation, désinfection et antisepsie, et donner pour chacune un exemple de situation où elle s'applique (bloc opératoire, plan de travail de cuisine, plaie superficielle).

Qu'est-ce que le transfert horizontal de gènes et en quoi se distingue-t-il de l'hérédité « verticale » des parents à la descendance ? Nommer ses trois mécanismes chez les bactéries.

Expliquer en quoi consiste la technique aseptique de travail au laboratoire de microbiologie et justifier le sens de deux pratiques concrètes : flamber l'anse d'ensemencement jusqu'au rouge et travailler près du bec Bunsen.

Différencier un antibiotique bactéricide d'un antibiotique bactériostatique, donner un exemple de chaque type (pénicilline et tétracyclines) et expliquer ce qui arrive à la population bactérienne à l'arrêt de chacun.

Qu'est-ce qu'un antibiogramme et comment le réalise-t-on (disques d'antibiotique déposés sur la boîte ensemencée) ? Expliquer ce qu'il indique au médecin (sensible, intermédiaire, résistant) et pourquoi il ne faudrait pas prescrire d'antibiotique sans cette information lorsqu'il est possible de l'obtenir.

Les virus ne se développent pas sur des boîtes de gélose. Justifier pourquoi (que leur manque-t-il pour se multiplier par eux-mêmes ?) et indiquer quels systèmes les laboratoires utilisent pour les cultiver (cultures cellulaires, œufs embryonnés).

Citer quatre méthodes de contrôle microbien dans l'industrie agroalimentaire (pasteurisation, stérilisation UHT, réfrigération et congélation, salaison ou saumurage) et expliquer le principe sur lequel repose chacune (tue-t-elle, inhibe-t-elle ou freine-t-elle la croissance ?).

Expliquer, en appliquant la sélection naturelle, comment apparaît une population bactérienne résistante à un antibiotique lorsque le traitement est interrompu trop tôt, et pourquoi l'antibiotique ne « crée » pas la résistance.

Le graphique représente la courbe de croissance d'une culture bactérienne en milieu fermé, avec ses quatre phases repérées par des numéros (1 à 4). Nommer chaque phase et expliquer ce qui se passe pour les nutriments et les déchets dans chacune.

Décrire les trois mécanismes de transfert horizontal de gènes chez les bactéries — conjugaison, transformation et transduction — en indiquant quel vecteur transporte l'ADN dans chaque cas et lequel intervient dans la diffusion des résistances.

Expliquer en quoi consiste la pasteurisation (température et durée, par exemple $72\ \text{°C}$ pendant $15$ secondes), pourquoi elle ne stérilise pas l'aliment (qu'est-ce qui survit ?) et quelles maladies historiques elle a aidé à maîtriser dans le lait (tuberculose, brucellose).

Une bactérie se divise toutes les $20$ minutes. En partant de $1\,000$ cellules en phase exponentielle, calculer combien il y en aura au bout de deux heures (combien de générations cela représente-t-il ?). Ensuite, justifier pourquoi la croissance exponentielle ne peut pas se maintenir dans une culture en milieu fermé (quels facteurs la freinent ?).

De nombreux antibiotiques sont des produits naturels de bactéries du sol (streptomycètes). Expliquer quel avantage évolutif procure à son producteur la fabrication d'un antibiotique (guerre chimique pour les nutriments) et analyser pourquoi la découverte de nouveaux antibiotiques a ralenti ces dernières décennies.

Comparer l'efficacité de l'eau de Javel, de l'alcool à $70\ \%$ et du savon contre les bactéries et contre les virus enveloppés. Expliquer pourquoi l'alcool à $70\ \%$ désinfecte mieux que l'alcool presque pur (rôle de l'eau dans la dénaturation des protéines et dans la pénétration) et ce que fait exactement le savon à une enveloppe virale lipidique.

Un bioréacteur industriel produit du yaourt, de la bière ou de l'insuline à grande échelle. Expliquer quels paramètres sont contrôlés en continu (température, pH, dioxygène dissous, agitation, mousse) et justifier ce qui arrive au produit si deux d'entre eux, au choix, sont déréglés.

Dans le service de réanimation d'un hôpital, une épidémie à Klebsiella pneumoniae résistante aux carbapénèmes est détectée ; elle touche quatre patients hospitalisés porteurs de cathéters veineux et sous ventilation mécanique.

1. a) Analyser la chaîne épidémiologique de l'épidémie : identifier la source probable, le mécanisme de transmission le plus plausible (véhicule et vecteur passif) et justifier quels facteurs physiologiques rendent ces patients particulièrement vulnérables.
2. b) Concevoir un plan d'action d'urgence avec des mesures de contrôle classées par ordre de priorité (isolement et barrières physiques, dépistage actif et désinfection des objets contaminés), en justifiant biologiquement pourquoi l'hygiène des mains entre les patients est plus déterminante pour freiner la transmission que la fumigation de l'environnement.
3. c) Évaluer de façon critique la proposition suivante : « Pour éradiquer l'épidémie à la racine, nous administrerons de la colistine à titre prophylactique à tous les patients hospitalisés en réanimation, qu'ils présentent ou non des symptômes. » Prédire les conséquences sélectives et évolutives de cette mesure à moyen terme.

Concevoir une expérience pour comparer l'efficacité de deux désinfectants contre une bactérie de la peau : boîtes, témoins, mesure des diamètres d'inhibition et critères pour conclure lequel est le plus efficace, en indiquant les variables que vous maintiendriez constantes.

Un patient diagnostiqué d'une grippe insiste pour qu'on lui prescrive de l'amoxicilline « au cas où l'infection descendrait dans les poumons », tandis qu'un éleveur administre de la tétracycline à faibles doses continues dans l'eau de boisson de porcs sains pour « accélérer leur engraissement et prévenir les diarrhées ».

1. a) Réfuter, à partir des bases biochimiques et cytologiques, l'exigence du patient : justifier pourquoi les antibiotiques bêta-lactamines sont totalement inoffensifs pour les virus et prédire quel impact sélectif immédiat cette amoxicilline aura sur le microbiote commensal du patient lui-même.
2. b) Interpréter la pratique d'élevage décrite du point de vue de la sélection naturelle : expliquer pourquoi des concentrations subthérapeutiques et continues constituent le scénario optimal pour sélectionner des bactéries résistantes, par comparaison avec des doses létales complètes.
3. c) Expliquer les mécanismes de transfert horizontal (conjugaison, transformation et transduction) par lesquels un gène de résistance apparu chez une bactérie commensale du bétail peut finir dans une souche pathogène humaine en milieu hospitalier.

Après un banquet scolaire, 48 convives développent une gastro-entérite aiguë due à Salmonella enterica. Lors de l'inspection, des échantillons des aliments consommés (mayonnaise maison, poulet rôti et gâteau) et du personnel de cuisine sont prélevés. Le laboratoire réalise l'isolement sur boîte et analyse le profil génétique par électrophorèse en champ pulsé (PFGE).

1. a) La culture est positive à S. enterica aussi bien dans la mayonnaise que dans des restes de poulet cru du plan de travail. Cependant, le profil de bandes d'ADN des malades coïncide à 100 % avec celui de l'isolat de la mayonnaise et diffère de celui de l'isolat du poulet cru. Interpréter ce résultat et déduire l'origine de l'intoxication, en justifiant pourquoi l'identification moléculaire est indispensable par rapport à la simple culture permettant d'identifier l'espèce.
2. b) La mayonnaise a été préparée avec des œufs à 7 h 30 et est restée à température ambiante (24,0 °C) jusqu'à sa consommation à 14 h 30 (7 heures au total). Si la contamination initiale du lot était de 10 bactéries/g et que le temps de doublement à cette température est de 30 minutes, calculer la concentration théorique finale par gramme et justifier comment le risque aurait été modifié par le maintien du plat au réfrigérateur à 4,0 °C dès sa préparation.
3. c) Concevoir un système de points de contrôle critiques (HACCP) pour la cuisine de l'établissement, qui prévienne simultanément la contamination biologique initiale, la contamination croisée et la prolifération microbienne.

Dans un atelier de conserves maison, deux groupes préparent de la choucroute (chou fermenté), dont la conservation dépend du microbiote lactique épiphyte (Leuconostoc et Lactobacillus) :

• Groupe 1 : il coupe le chou, ajoute 2,5 % de sel ordinaire en masse, presse le mélange jusqu'à ce que le liquide recouvre complètement le végétal et ferme le bocal en empêchant l'entrée d'air, en le maintenant à 20,0 °C. Au bout de trois semaines, la préparation a un pH de 3,6 et une odeur acide franche.

• Groupe 2 : il coupe le chou, n'ajoute pas de sel pour « que ce soit meilleur pour le cœur », laisse le bocal ouvert à l'air et ajoute de l'eau chaude à 45,0 °C. Au bout de 4 jours, le pH reste à 6,2, il y a des moisissures à la surface et une odeur fétide se dégage.

1. a) Justifier le double rôle sélectif des 2,5 % de sel et de l'immersion en anoxie dans la procédure du groupe 1 vis-à-vis des bactéries concurrentes d'origine tellurique et des entérobactéries.
2. b) Expliquer le changement métabolique que provoque la chute du pH jusqu'à 3,6 et justifier pourquoi cette baisse inhibe le développement des endospores de Clostridium botulinum, un bacille anaérobie strict qui tolère l'anoxie mais est sensible à l'acidité.
3. c) Prédire quelles défaillances biochimiques et écologiques le protocole du groupe 2 a provoquées et pourquoi la combinaison d'une température de 45,0 °C et de la présence de dioxygène a empêché la fermentation lactique spontanée.

La colistine est un antibiotique polypeptidique qui déstabilise la membrane externe des bactéries à Gram négatif et qui a longtemps été considéré comme un médicament de « dernier recours ». En 2015, le gène mcr-1, capable de conférer une résistance à la colistine et situé sur un plasmide conjugatif, a été détecté dans des élevages porcins.

1. a) Justifier pourquoi la découverte du gène mcr-1 sur un plasmide a suscité une alerte sanitaire mondiale incomparablement plus forte que si la résistance était due à une mutation ponctuelle du chromosome bactérien.
2. b) Pendant des décennies, la colistine a été administrée à faibles doses continues chez les porcs comme facteur de croissance. Expliquer, à partir de la théorie de la sélection naturelle, comment cette pratique zootechnique a créé les conditions idéales pour la sélection et la fixation du gène mcr-1.
3. c) En vous appuyant sur la stratégie « Une seule santé » (One Health), argumenter pourquoi la législation a interdit l'usage préventif de la colistine en élevage et réfuter la position d'un producteur qui prétendrait que « les bactéries de l'intestin du bétail n'ont aucun moyen d'atteindre les patients d'un service de réanimation humain ».

Dans l'unité de stérilisation d'un hôpital, il faut traiter :

1) Des boîtes d'instruments chirurgicaux en acier inoxydable (forceps, écarteurs).

2) Des laparoscopes et des optiques endoscopiques comportant de la fibre de verre et des plastiques thermosensibles (température maximale tolérée : 55,0 °C).

3) Des seringues et des cathéters en plastique jetables, conditionnés en grandes quantités dans des boîtes en carton fermées.

1. a) Attribuer et justifier la méthode optimale pour chaque matériel parmi : autoclave à vapeur sous pression, chambre à gaz d'oxyde d'éthylène et rayonnement ionisant gamma, en détaillant pourquoi les méthodes écartées dans chaque cas seraient moins adaptées (elles abîmeraient le matériel, ne pénétreraient pas correctement ou seraient moins pratiques ou moins sûres).
2. b) Pendant un cycle d'autoclave (134,0 °C pendant 5 minutes), le thermomètre et le manomètre ont enregistré les valeurs prescrites et le ruban adhésif témoin externe a bien changé de couleur. Cependant, lors de l'incubation de l'indicateur biologique (ampoule contenant 10^6 endospores de Geobacillus stearothermophilus placée au centre de la charge) à 56,0 °C pendant 24 heures, le bouillon passe du violet au jaune et devient trouble.

Interpréter ce qui s'est passé, décider de façon argumentée si l'utilisation des instruments peut être autorisée et justifier pourquoi le contrôle biologique prévaut sur les contrôles physiques et chimiques.

Un patient atteint de mucoviscidose souffre d'une infection pulmonaire chronique due à une souche de Pseudomonas aeruginosa panrésistante (résistante à tous les antibiotiques disponibles). L'équipe médicale envisage un usage compassionnel de la phagothérapie.

1. a) Au laboratoire, deux types de bactériophages sont disponibles : le phage ΦA (strictement lytique) et le phage ΦB (phage lysogène ou tempéré). Justifier lequel des deux doit obligatoirement être choisi pour le traitement et quel risque clinique grave représenterait l'administration du phage lysogène.
2. b) Après administration d'une dose de phages lytiques par inhalation, la charge bactérienne dans les expectorations passe en 72 heures de 8,0 · 10^7 à 3,0 · 10^2 UFC/mL, tandis que le titre en phages augmente de 1,0 · 10^5 à 4,5 · 10^9 UFP/mL. Comparer cette cinétique à la pharmacocinétique d'un antibiotique chimique traditionnel et en déduire quel avantage présente le bactériophage en matière de dosage au niveau du foyer infectieux.
3. c) Au jour 14, la charge bactérienne du patient remonte à 6,0 · 10^6 UFC/mL. L'analyse montre que les bactéries survivantes ont perdu le récepteur membranaire OprM que le phage utilisait pour se fixer. Expliquer pourquoi un traitement conçu sous forme de « cocktail » de plusieurs phages ciblant des récepteurs cellulaires indépendants réduit au minimum le risque d'échec par rapport à l'utilisation d'une seule souche virale.

Défi du thème. Votre cuisine est-elle un milieu de culture idéal pour les pathogènes ou un environnement hostile digne d'une archée extrémophile ? Concevoir un protocole de biosécurité alimentaire pour votre foyer.

1. Recueil de données : Mesurer avec un thermomètre la température à l'intérieur de votre réfrigérateur et sur votre plan de travail, ou consulter la température actuelle de votre commune sur le site de Météo-France. Noter les deux valeurs (par exemple, $4,1\text{ }^\circ\text{C}$ et $21,8\text{ }^\circ\text{C}$).

2. Analyse microbienne : Élaborer un tableau comparant la plage optimale de prolifération des eubactéries mésophiles courantes aux adaptations des archées extrémophiles (psychrophiles ou thermophiles), en déduisant quels micro-organismes prospéreraient dans chaque zone mesurée.

3. Stratégies de contrôle : Proposer trois mesures de contrôle de la croissance bactérienne pour des aliments du quotidien (comme la chaleur à plus de $72,5\text{ }^\circ\text{C}$, la salaison osmotique ou la réfrigération), en expliquant comment elles altèrent la viabilité de la paroi ou de la membrane bactérienne.

4. Production finale : Rédiger un court rapport d'une page rassemblant vos mesures, le tableau comparatif eubactéries-archées et votre protocole de conservation argumenté.

Seront évalués :

• Un relevé rigoureux de données thermiques réelles en utilisant la virgule décimale.

• Une distinction biologique correcte entre la physiologie des eubactéries et celle des archées.

• Une justification scientifique des méthodes de culture et de contrôle microbien appliquées.