Exercices: L'extraction de l'ADN

Expliquer avec vos propres mots ce que signifie extraire l'ADN d'une cellule eucaryote et citer deux matériaux simples dont on peut obtenir les cellules pour la manipulation (par exemple, la muqueuse de la joue ou un fruit). Pourquoi convient-il de bien broyer le matériel avant de commencer ?

Dans la manipulation d'extraction de l'ADN, on utilise un liquide vaisselle, du sel et de l'alcool très froid. Expliquer le rôle de chaque réactif : quelles structures de la cellule le détergent dissout, à quoi sert le sel et ce qui arrive à l'ADN lorsqu'il entre en contact avec l'alcool.

Observer le schéma du tube à essai à la fin de la manipulation d'extraction de l'ADN. Identifier ce que désignent les repères ?1, ?2 et ?3 (la couche d'alcool, l'extrait aqueux contenant l'ADN dissous et les filaments d'ADN qui apparaissent à la zone de contact) et expliquer pourquoi l'ADN se concentre précisément dans cette zone.

Expliquer pourquoi presque n'importe quel tissu convient pour extraire de l'ADN, par exemple une feuille de laitue ou un morceau de poulet, à condition que ses cellules possèdent un noyau. Qu'ont en commun toutes ces cellules ?

Après avoir broyé le matériel avec le mélange d'extraction, la manipulation se poursuit par la filtration de l'ensemble. Expliquer ce qui est retenu dans le filtre, ce qui passe dans le bécher et pourquoi il est utile de se débarrasser de la partie solide.

Énumérer le matériel de laboratoire nécessaire à la manipulation d'extraction de l'ADN (bécher, passoire ou filtre, tube à essai, baguette de verre) et expliquer à quoi sert chacun.

Dans le tube, l'ADN passe de l'état dissous dans l'extrait à un précipité de filaments lors de l'ajout d'alcool. Expliquer si la molécule d'ADN a changé chimiquement au cours de ce processus ou si seul son état physique a changé, et comparer avec ce qui arrive au sel lorsqu'il précipite dans l'eau.

Bien que la manipulation utilise des ingrédients de cuisine, elle se fait dans un laboratoire. Citer deux règles de sécurité à respecter (par exemple, ne rien goûter et tenir l'alcool éloigné de toute flamme) et expliquer la raison de chacune.

Ces étapes de la manipulation d'extraction de l'ADN sont dans le désordre : ajouter l'alcool très froid le long de la paroi du tube sans agiter ; broyer le matériel ; préparer le mélange d'eau, de sel et de détergent ; filtrer l'ensemble ; recueillir les filaments d'ADN avec une baguette. Les remettre dans l'ordre et justifier pourquoi chaque étape doit se trouver à cette place.

L'alcool de la manipulation doit être très froid et il faut le verser avec précaution, de manière à former une couche au-dessus de l'extrait sans se mélanger avec lui. Expliquer quel avantage présente un alcool froid pour la solubilité de l'ADN et pourquoi il est préférable que les deux couches ne se mélangent pas.

À la fin de la manipulation apparaît, à la zone de contact entre l'extrait et l'alcool, une sorte de nuage blanchâtre formé de filaments. Décrire ce que l'on observe et expliquer ce qu'est réellement ce matériel — ce n'est ni une seule molécule ni l'ADN d'une seule cellule — et pourquoi il est visible à l'œil nu alors qu'une molécule d'ADN ne l'est pas.

Un camarade propose d'extraire de l'ADN humain à partir d'une goutte de sang. Expliquer pourquoi les globules rouges ne conviennent pas pour cette manipulation et quelles cellules du sang il faudrait utiliser à la place.

Le liquide vaisselle dissout les membranes cellulaires parce que celles-ci sont formées d'une bicouche de phospholipides. Expliquer l'analogie avec l'action du détergent lorsqu'on lave une assiette grasse et ce qui arrive alors au contenu de la cellule.

Concevoir une expérience pour déterminer de quel fruit, entre la banane, le kiwi et la fraise, on obtient le plus d'ADN avec le même protocole. Indiquer quelles variables vous maintiendriez constantes pour que la comparaison soit équitable et laquelle vous mesureriez pour comparer les résultats.

Une cellule humaine contient environ $6\ \text{pg}$ d'ADN ($6 \cdot 10^{-12}\ \text{g}$). Estimer combien de cellules il faudrait pour obtenir $1\ \text{mg}$ d'ADN et expliquer pourquoi, en pratique, il faut broyer une bonne quantité de matériel.

L'ADN est soluble dans l'extrait aqueux salé, mais insoluble dans l'alcool froid, tandis que de nombreuses protéines et débris de membrane restent dans le liquide. Expliquer la différence entre dissoudre et précipiter, et pourquoi ce changement de solubilité permet de séparer l'ADN d'une grande partie des impuretés.

Vous voulez extraire de l'ADN d'une fraise et d'un oignon en appliquant le même protocole. Expliquer quels ajustements pourraient être nécessaires pour le broyage ou la quantité de détergent selon la dureté de chaque tissu, et prévoir de laquelle des deux vous attendez le plus d'ADN visible, sachant que la fraise est octoploïde : ses cellules possèdent huit jeux de chromosomes au lieu de deux.

Lors de la manipulation d'extraction d'ADN végétal, trois groupes obtiennent des résultats ratés :

• Groupe A : il a broyé le tissu végétal dans un mixeur à pleine puissance pendant dix minutes et n'observe pas de filaments, seulement un liquide trouble sans filaments distincts.

• Groupe B : il a ajouté de l'alcool à 96 % à température ambiante ($22\ ^\circ\text{C}$) au lieu de le refroidir au préalable à $-20\ ^\circ\text{C}$, et observe à peine un précipité à l'interface.

• Groupe C : il a agité énergiquement le tube à essai avec une baguette dès qu'il a versé l'alcool, et les fibres qui commençaient à s'agglomérer se sont défaites.

Justifier ce qui s'est produit à l'échelle physique ou moléculaire dans chaque cas pour expliquer l'échec de l'extraction.

Lors d'une enquête de police scientifique, on recueille un minuscule échantillon biologique (un cheveu avec sa racine, qui ne contient que quelques dizaines de cellules). Un élève affirme : « On peut utiliser le protocole maison de la fraise : on broie, on ajoute du liquide vaisselle, du sel et de l'alcool, puis on lit les gènes avec une loupe. » Réfuter son affirmation en identifiant trois limites insurmontables de cette méthode scolaire et justifier quelles techniques avancées (comme l'amplification par PCR ou la purification enzymatique) sont indispensables dans un vrai laboratoire pour analyser l'échantillon.

Un groupe d'élèves souhaite adapter le protocole d'extraction d'ADN végétal à un tissu animal (blanc de poulet). Ils proposent de supprimer deux étapes : le broyage mécanique initial (car la viande est plus tendre qu'une paroi végétale) et l'ajout de détergent (car les cellules animales n'ont pas de paroi cellulaire).

Évaluer de façon critique leurs deux propositions : justifier s'il est judicieux de se passer de chacune de ces étapes en fonction de l'organisation des cellules animales et prévoir ce qu'ils obtiendraient s'ils supprimaient le détergent.

À la fin de la manipulation avec la fraise et le kiwi, un élève compare les deux tubes et affirme : « L'ADN des deux fruits a exactement le même aspect (une masse blanchâtre et filamenteuse). Cela prouve qu'à l'échelle moléculaire l'ADN de toutes les espèces est identique et que l'extraction ne permet pas de les différencier. » Réfuter sa conclusion en distinguant quelle partie de la molécule d'ADN est universelle pour tous les êtres vivants et laquelle contient réellement l'information qui permet à un laboratoire de séquencer et d'identifier l'espèce.

Pour identifier un suspect, un laboratoire coupe les échantillons d'ADN avec des enzymes et soumet les fragments à une électrophorèse sur gel d'agarose :

1. a) Si l'ADN porte une charge nette négative en raison de ses groupes phosphate, déduire en justifiant vers quel pôle électrique (positif ou négatif) les fragments migreront lorsqu'on branche le courant.
2. b) Si un échantillon contient des fragments d'ADN de $300$ paires de bases et d'autres de $2500$ paires de bases, prévoir lesquels seront les plus éloignés du puits de dépôt dans le maillage du gel et justifier la raison physique.
3. c) Interpréter ce que signifierait le fait que le profil de bandes du suspect coïncide exactement, en position et en nombre, avec celui de l'échantillon retrouvé sur le lieu du crime.

L'ADN obtenu avec le protocole scolaire n'est pas pur : il précipite avec des protéines (histones) et des lipides. Une équipe propose d'ajouter du jus d'ananas naturel (riche en bromélaïne, une enzyme protéase) au filtrat avant d'ajouter l'alcool. Une autre équipe propose de chauffer le filtrat à $100\ ^\circ\text{C}$ pendant $15$ minutes pour éliminer les impuretés protéiques.

Évaluer les deux propositions : justifier laquelle des deux est appropriée en expliquant l'action de la protéase sur les histones, et prévoir l'effet contre-productif que ferait subir à la molécule d'ADN le fait de porter l'échantillon à ébullition.

Une molécule d'ADN a une épaisseur d'environ $2\ \text{nm}$, alors que les filaments visibles lors de la manipulation mesurent quelques dixièmes de millimètre, par exemple $0{,}5\ \text{mm}$. Estimer combien de molécules d'ADN regroupées tiennent dans l'épaisseur d'un filament et relier le résultat au fait que l'ADN précipité soit visible à l'œil nu.