Aufgaben: Genregulation und Genome

Alle Zellen deines Körpers besitzen dieselbe DNA, dennoch unterscheiden sich eine Nervenzelle und eine Muskelzelle stark. Erkläre, worauf dieser Unterschied beruht, und beziehe dich dabei auf die Genexpression.

Was ist ein konstitutives Gen und was ist ein regulierbares Gen? Nenne je ein Beispiel und erkläre, warum es für die Zelle vorteilhaft ist, einige ihrer Gene zu regulieren.

Nenne zwei allgemeine Unterschiede zwischen dem Genom einer Prokaryotenzelle und dem einer Eukaryotenzelle (Lage, Form der DNA, Vorhandensein von Introns).

Was ist ein Operon? Gib an, in welchen Organismen es vorkommt, und nenne die Grundbestandteile eines induzierbaren Operons wie des lac-Operons.

Definiere Intron und Exon und gib an, was bei der Reifung der mRNA in Eukaryotenzellen mit den einen und den anderen geschieht.

Was ist ein Transkriptionsfaktor? Erkläre kurz, welche Rolle er bei der Regulation der Genexpression spielt und an welche DNA-Bereiche er bindet.

Was bedeutet es, dass ein Gen in einer Zelle stillgelegt ist? Erkläre eine Möglichkeit, wie die Zelle verhindern kann, dass ein bestimmtes Gen transkribiert wird.

Das menschliche Genom enthält etwa $20000$ proteincodierende Gene, die jedoch nur einen kleinen Teil der gesamten DNA einnehmen. Gib an, welche anderen Arten von Sequenzen das Genom enthält und welche Funktionen einigen der nicht codierenden Bereiche zugeschrieben werden.

Das Schema zeigt das lac-Operon von Escherichia coli in zwei Situationen (A und B). Gib an, in welcher davon Lactose im Medium vorhanden ist, benenne die gekennzeichneten Elemente (P, O, Z-Y-A und ?) und erkläre, was in jeder Situation mit der Expression der Strukturgene geschieht.

Was ist ein Promotor und welche Rolle spielt er bei der Regulation der Transkription? Erkläre, was geschehen kann, wenn eine Mutation den Promotor eines Gens funktionsunfähig macht.

In Eukaryotenzellen wird die DNA an Histone gebunden verpackt und bildet das Chromatin. Erkläre, wie der Kondensationsgrad des Chromatins die Genexpression beeinflusst.

Ein E.-coli-Stamm wächst in einem Medium mit Glucose und ohne Lactose. Erkläre, in welchem Zustand sich das lac-Operon unter diesen Bedingungen befindet, und beschreibe, was mit der Expression seiner Strukturgene geschieht, wenn die Glucose aufgebraucht ist und dem Medium Lactose zugesetzt wird.

In Eukaryotenzellen gibt es regulatorische Sequenzen, sogenannte Enhancer, die tausende Basenpaare von dem Gen entfernt liegen können, das sie regulieren. Erkläre, wie sie über eine so große Entfernung wirken können, und beziehe dich dabei auf die Faltung des Chromatins und auf Transkriptionsfaktoren.

MicroRNAs sind kleine RNAs, die keine Proteine codieren, aber die Genexpression regulieren. Erkläre, wie sie auf ihre Ziel-mRNAs wirken, ob ihre Wirkung aktivierend oder hemmend ist und warum sie als Ebene der posttranskriptionalen Regulation gelten.

Vergleiche die Regulation der Genexpression bei Prokaryoten und Eukaryoten (Anzahl der Kontrollebenen, Reaktionsgeschwindigkeit auf die Umwelt, Organisation der Gene) und begründe, warum es in Eukaryotenzellen mehr mögliche Regulationspunkte gibt.

Nur etwa $1,5\ \%$ des menschlichen Genoms entsprechen proteincodierenden Sequenzen. Berechne, wie vielen Basenpaaren dieser Anteil in einem Genom von $3 \cdot 10^9$ Basenpaaren entspricht, und erkläre, was man heute über den Rest des Genoms weiß (regulatorische Sequenzen, Introns, mobile Elemente, repetitive Sequenzen).

In einer Biopsie eines kolorektalen Karzinoms wird festgestellt, dass das Tumorsuppressorgen MLH1 vollständig stillgelegt ist, wodurch die Reparatur von Basenfehlpaarungen in der DNA verhindert wird. Bei der Sequenzierung des Gens im Tumor ist seine Nukleotidsequenz mit der des gesunden Gewebes identisch; eine molekulare Analyse zeigt jedoch eine dichte Hypermethylierung von Cytosinen in CpG-Inseln seiner Promotorregion. Bei der Kultivierung der Tumorzellen mit 5-Azacytidin (Hemmstoff der DNA-Methyltransferasen) setzt die Expression von MLH1 wieder ein.

1. a) Begründen Sie anhand dieser Daten, warum die Stilllegung von MLH1 in diesem Tumor ein epigenetisches Ereignis und keine genetische Mutation darstellt.
2. b) Erklären Sie den physikalisch-molekularen Mechanismus, durch den Methylgruppen an den Cytosinen des Promotors die Transkription des Gens verhindern, und beziehen Sie sich dabei auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren und die Chromatinremodellierung.
3. c) Wenn sich diese mit 5-Azacytidin behandelten Tumorzellen in einem Medium ohne das Medikament teilen, können die neuen Zellgenerationen das Methylierungsmuster erben und das Gen erneut stilllegen. Begründen Sie, wie die DNA-Methylierung bei der Zellreplikation durch Erhaltungs-Methyltransferasen aufrechterhalten und weitergegeben wird.

Analysieren Sie die folgende Tabelle mit Genomdaten von drei repräsentativen Organismen:

1. a) Ein Schüler behauptet, Paris japonica müsse, da ihr Genom fast 50-mal größer ist als das des Menschen, eine proportional höhere biologische und anatomische Komplexität besitzen. Widerlegen Sie seine Behauptung anhand der Daten und erklären Sie, worin das C-Wert-Paradoxon besteht.
2. b) Begründen Sie anhand der Daten der Tabelle, welche Arten von Sequenzen den Großteil der nicht codierenden DNA bei Eukaryoten ausmachen und warum ein Bakterium einen so hohen Anteil nicht codierender DNA nicht tolerieren kann.

In einem Labor wird ein mutanter Escherichia-coli-Stamm untersucht, der eine vollständige Deletion im Regulatorgen lacI aufweist (Phänotyp I⁻). Ein Schüler sagt voraus, dass dieses Bakterium die Strukturgene des lac-Operons unter allen Umständen maximal transkribiert, da der Repressor nie an den Operator bindet.

Um seine Hypothese zu überprüfen, wird der Stamm in drei Medien mit gleichwertigen Konzentrationen an Grundnährstoffen kultiviert:

• Medium A: Glucose als einzige Kohlenstoffquelle.

• Medium B: gleichzeitiges Vorhandensein von Glucose und Lactose.

• Medium C: Lactose als einzige Kohlenstoffquelle.

1. a) Beurteilen Sie, ob die Vorhersage des Schülers zutrifft. Begründen Sie, welches Transkriptionsniveau des Operons (null, sehr niedrig basal oder hoch) in jedem der drei Medien zu beobachten ist, und beschreiben Sie den beteiligten molekularen Mechanismus (Rolle des CAP-cAMP-Komplexes und der Adenylatcyclase).
2. b) Sagen Sie begründet vorher, was mit der Transkription in Medium C geschähe, wenn der Stamm eine zweite Mutation erführe, die das Gen des CAP-Proteins inaktiviert.

Bei haploiden Bakterien verhindern sowohl eine Nullmutation im Repressorgen (I⁻) als auch eine Punktmutation in der Operatorsequenz (Oᶜ) die Repression des lac-Operons und führen in Abwesenheit von Lactose zu einem konstitutiven Phänotyp.

Um beide Mechanismen zu unterscheiden, erzeugten François Jacob und Jacques Monod mithilfe von F'-Plasmiden partiell diploide Stämme (Merozygoten). Analysieren Sie die beiden folgenden Stämme:

• Stamm 1: I⁺ Oᶜ Z⁺ / I⁺ O⁺ Z⁻

• Stamm 2: I⁺ O⁺ Z⁻ / I⁻ O⁺ Z⁺

(wobei Z⁺ funktionsfähige β-Galactosidase und Z⁻ ein nicht funktionsfähiges Enzym codiert).

1. a) Sagen Sie begründet vorher, ob in Stamm 1 und in Stamm 2 aktive β-Galactosidase gebildet wird, wenn sie in einem Medium ohne Lactose kultiviert werden.
2. b) Ordnen Sie anhand Ihrer Vorhersage Repressor und Operator als in cis oder in trans wirkende Regulatoren ein und begründen Sie den molekularen Unterschied zwischen beiden Kontrolltypen.

In einem Experiment mit kultivierten Hepatozyten wird der Wirkmechanismus zweier Hormone verglichen: Adrenalin (wasserlösliches Hormon, das über einen G-Protein-gekoppelten Membranrezeptor wirkt) und Cortisol (fettlösliches Steroidhormon, das an einen intrazellulären Rezeptor bindet).

Um den Signalweg zu untersuchen, wird der Hälfte der Kulturen Actinomycin D zugesetzt (ein starker Transkriptionshemmer, der die RNA-Polymerase II blockiert). Anschließend wird die Zellantwort (Enzymaktivierung und Glucosesynthese) im zeitlichen Verlauf gemessen.

1. a) Deuten Sie und begründen Sie, warum die durch Adrenalin ausgelöste Zellantwort nur Sekunden oder Minuten bis zur Ausprägung braucht, während die durch Cortisol mehrere Stunden erfordert.
2. b) Sagen Sie vorher, wie sich die Anwesenheit von Actinomycin D auf die von beiden Hormonen erzeugte Antwort auswirkt. Begründen Sie Ihre Antwort auf molekularer Ebene.
3. c) Begründen Sie, warum nach dem Auswaschen des Mediums und dem Entfernen beider Hormone die durch Cortisol induzierten Stoffwechselwirkungen deutlich länger anhalten als die von Adrenalin.

Ende des 19. Jahrhunderts vertrat August Weismann die Ansicht, die Zelldifferenzierung während der Embryonalentwicklung beruhe auf einem selektiven, fortschreitenden Verlust von Genen: Jede Zelllinie behalte nur die DNA, die sie für ihre spezialisierte Funktion benötige.

1. a) Beschreiben Sie das Prinzip eines historischen Experiments (wie den Kerntransfer bei Amphibien von Gurdon oder das Klonen des Schafs Dolly) und begründen Sie, wie seine Ergebnisse die Hypothese Weismanns endgültig widerlegten.
2. b) Wenn eine Nervenzelle und ein Hepatozyt desselben erwachsenen Menschen genau dasselbe Genom besitzen, begründen Sie, welche molekularen Mechanismen (spezifische Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierung und Histonacetylierung) es jeder von ihnen ermöglichen, einen weitgehend verschiedenen Satz von Proteinen zu exprimieren und ihre Identität stabil zu erhalten.

Bei Drosophila melanogaster führt die dominante Gain-of-Function-Mutation Antennapedia (Antp) dazu, dass das Gen Antp, dessen normale Expression auf das zweite Thoraxsegment beschränkt ist und dort die Beinentwicklung induziert, fälschlicherweise in den Imaginalscheiben des Kopfes transkribiert wird. Infolgedessen entwickeln die Fliegen anstelle von Antennen vollständig ausgebildete Beine.

1. a) Leiten Sie aus diesem Fall ab, welche molekulare Funktion die von den homöotischen Genen (Hox) codierten Proteine haben, und erklären Sie, wie die Aktivierung eines einzigen Gens die koordinierte Morphogenese eines kompletten Anhangs auslösen kann.
2. b) Ein Schüler stellt die Hypothese auf, dass bei einer Fliege mit einer Nullmutation durch Deletion von Antp in Homozygotie (vollständiger Funktionsverlust) der Embryo ohne Kopf geboren würde. Widerlegen Sie diese Hypothese und sagen Sie begründet vorher, welche anatomische Veränderung Sie im Thorax dieses Individuums erwarten würden.

Ein Biotechnologieteam entwirft ein Plasmid, damit Escherichia coli rekombinantes menschliches Insulin produziert. Im ersten Versuch klonierte es direkt das aus der Kern-DNA gewonnene menschliche Gen (mit Introns und Exons) zusammen mit einem starken konstitutiven bakteriellen Promotor. Das Ergebnis war ein Misserfolg: Die Zellkultur starb vorzeitig durch toxische Anreicherung von anomalem, nicht funktionsfähigem Protein.

1. a) Benennen Sie die beiden grundlegenden Fehler im Design und erklären Sie die biologischen und molekularen Ursachen dieses Misserfolgs.
2. b) Entwerfen Sie die Strategie neu und nutzen Sie dabei das Regulationssystem des lac-Operons: Geben Sie an, welche Art von Nukleinsäure als Vorlage für die codierende Sequenz verwendet werden muss, welche unverzichtbaren bakteriellen Regulationselemente der Expressionsvektor enthalten muss und wie die Induktion im Fermenter zeitlich gesteuert wird, damit das Bakterium zunächst eine hohe Zelldichte erreicht, bevor die Proteinsynthese beginnt.